BTN60905 MMLV逆转录酶

MMLV逆转录酶说明书
产品编号：BTN60905
规格：10000U/50000U
产品及特点：
该酶是突变型的MMLV 逆转录DNA 聚合酶，从表达Moloney Murine Leukemia Virus （莫洛尼氏鼠白血病病毒）reverse transcriptase 基因(pol 基因)的E.coli 细胞中分离纯化而得，由一个分子量为76.1 KDa 的单亚基组成，可催化以单链DNA、RNA 或DNA：RNA 杂交链为模板的互补DNA 链的聚合反应。跟野生型相比,它没有RNase H 活性。
1. 延伸性能好，可合成长达12.5 Kb 的fμLl-length cDNA。
2. 最佳反应温度为42℃，但在50℃时仍然有活性，70℃10 分钟能使其失活。
3. 能以Cy3-，Cy5-，rhodamine-， aminoallyl-，fluorescein 等标记的nucleotides 为底物。
4. 可用于first strand cDNA 合成，second strand cDNA 合成，DNA labeling，RNA primer extension 等。
5. 与PCR 兼容，RT 产物可以用于PCR 和real-time PCR。
6. 能被金属螯合剂，无机磷酸，焦磷酸和多胺抑制。
7. 没有RNase H 活性。
规格及成分：

成分	10000U	50000U
MMLV 逆转录酶 (200 U/μL)	50μl	50μl×5
5×RT Buffer	1ml	1ml×5
说明书	1份	1份

保存条件：
低温运输，-20℃保存，有限期一年。
使用方法：
一：合成PCR 用的1st-strand cDNA
1. 按下表配制RT 反应体系:

RNA	模板
总RNA	100-500 ng
或poly(A) mRNA	10-500 ng
或专一的RNA	0.01pg-500ng

注意：RNA 样品不能有基因组DNA污染。
 
 
引物

Oligo (dT)18(0.5ug/μL)	1 μL
或随机引物(0.2ug/μL)	1 μL
或RNA 模板专一性引物	15-20pmol

注意：随机引物于RNA 模板的比例跟最后得到的cDNA 的平均长度成反比。
RNase-free 水     补水到12 μL
2. 70℃保温5 分钟后立即冰浴。
3. 严格按下表顺序加入各成分：

5×RT Buffer	4 μL
RNase Inhibitor (20U/μL)	1 μL
dNTP (10 mM each)	2 μL

4. 37℃保温5 分钟。对富含二级结构的高GC RNA 模板，可以改成45℃保温5 分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是25℃（5 分钟）。
5. 加入1 μL (=200 U) MMLV 逆转录酶，反应终体积为20μL。
6. 42℃保温60 分钟（但如果使用随机引物，需要先25℃保温10 分钟，然后再转移到42℃保温60 分钟）。
7. 70℃保温10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的cDNA 可以直接作为PCR 模板使用，不需要纯化。
二：合成建文库用的1st-strand cDNA
1. 按下表配制RT 反应体系:

RNA	模板
或poly(A) mRNA	1 ug
或专一的RNA	0.5-1ug

注意：RNA 样品不能有基因组DNA污染。
引物

Oligo (dT)18(0.5ug/μL)	1 μL
或随机引物(0.2ug/μL)	1 μL
或RNA 模板专一性引物	100pmol

注意：随机引物于RNA模板的比例跟最后得到的cDNA 的平均长度成反比。
RNase-free 水    补水到12 μL
2. 70℃保温5 分钟后立即冰浴。
 
 
 
3. 严格按下表顺序加入各成分：

5×RT Buffer	4 μL
RNase Inhibitor (20U/μL)	1 μL
dNTP (10 mM each)	2 μL

4. 37℃保温5 分钟。对富含二级结构的高GC RNA 模板，可以改成45℃保温5 分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是25℃（5 分钟）。
5. 加入1 μL (=200 U) MMLV 逆转录酶，反应终体积为20μL。
6. 42℃保温60 分钟（但如果使用随机引物，需要先25℃保温10 分钟，然后再转移到42℃保温60 分钟）。
7. 70℃保温10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的cDNA 可以用于第二链cDNA 的合成或放置在-20℃。