BTN60906 cDNA第一链合成试剂盒

cDNA第一链合成试剂盒说明书
产品编号：BTN60906
规格：10T/50T
产品及特点：
本试剂盒提供合成cDNA 第一链所需要的全部试剂。其原理是用突变的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶（M-MμLV RT）高效合成mRNA 的全长cDNA 拷贝。
1. 使用突变的反转录酶，内源RNase H 活性低。
2. 最长可合成13 Kb 的cDNA。
3. 可以使用oligo-dT、随机引物和RNA 专一性引物三种引物（前两种本试剂盒提供）。
4. 总RNA、poly(A)+RNA 或特殊RNA 均可作为模板。
5. 可用于cDNA 文库构建、RT-PCR、探针标记等。
规格及成分：

成分	规格
MMLV（含RI）	100μl
RT Buffer（含dNTP）	300μl
Oligo (dT)18 引物(0.5 ug/μL)	50μl
Random Primer(0.2 ug/μL)	50μl
RNase-free水	1ml
说明书	1份

保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
使用方法：
一：合成PCR 用的1st-strand cDNA

• 按下表配制RT 反应体系:

RNA 模板
总RNA	100-500ng
或poly(A) mRNA	10-500ng
或专一的RNA	0.01pg-500ng
注意：RNA 样品不能含有基因组DNA 污染。

引物

Oligo (dT)18(0.5 ug/μL)	1μl
或随机引物(0.2 ug/μL)	1μl
或RNA 模板专一性引物	15-20 pmol
注意：随机引物与RNA 模板的比例跟cDNA 合成的平均长度成反比。
RNase-free水	补水到13μL

2. 70℃保温5 分钟后立即冰浴。
3. 再加入5 μL RT Buffer（含dNTP）。
4. 37℃保温5 分钟。对富含二级结构的高GC RNA 模板，可以改成45℃保温5 分钟。如果使用随机引物，则改成25℃ 5 分钟。
5. 加入2 μL MMLV 逆转录酶（含RI），反应终体积为20 μL。
6. 42℃保温60 分钟（但如果使用随机引物，需要先25℃保温10 分钟，然后再转移到42℃保温60 分钟）。此步为RT 反应。
7. 70℃保温10 分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的cDNA 可以直接作为PCR 模板使用，不需要纯化。
二：合成建文库用的1st-strand cDNA

• 按下表配制RT 反应体系:

RNA模板
poly(A) mRNA	1μg
或专一的RNA	0.5-1μg
注意：RNA样品不能含有基因组DNA 污染。
引物
Oligo (dT)18(0.5μg/μL)	1μl
或随机引物(0.2μg/μL)	1μl
或RNA模板专一性引物	100 pmol
注意：随机引物于RNA模板的比例跟cDNA合成的平均长度成反比。
RNase-free水	补水到13μL

2. 70℃保温5 分钟后立即冰浴。
3. 再加入5 μL RT Buffer（含dNTP）。
4. 37℃保温5 分钟。对富含二级结构的高GC RNA 模板，可以改成45℃保温5 分钟。如果使用随机引物，则改成25℃ 5 分钟）。
5. 加入2 μL MMLV 逆转录酶（含RI），反应终体积为20μL。
6. 42℃保温60 分钟（但如果使用随机引物，需要先25℃保温10 分钟，然后再转移到42℃保温60 分钟）。此步为RT 反应。
7. 70℃保温10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的cDNA 可以用于第二链cDNA 的合成或放置在-20℃长期保存。
三：用对照模板合成cDNA(需要用同位素，需要对照的客户需要单独跟百奥莱博联系)

• 按下表配制RT 反应体系:

对照RNA模板(0.5μg/μL)	2μl
引物
Oligo(dT)18(0.5μg/μL)	1μl
或随机引物(0.2μg/μL)	1μl
或对照专用引物	2μl
RNase-free水	补水到13μl

2. 70℃保温5 分钟后立即冰浴。
3. 再加入5 μL RT Buffer（含标记dNTP，本试剂不提供）。
4. 37℃保温5 分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是25℃。
5. 加入2 μL MMLV 逆转录酶（含RI），反应终体积为20μL。
6. 42℃保温60 分钟（但如果使用随机引物，需要先25℃保温10 分钟，然后再转移到42℃保温60 分钟）。
7. 加1μL 0.5M EDTA，放置在冰上待用。
8. 电泳检测。合成的cDNA 的量一般有加入RNA 总量的50%以上，电泳一般能出现1.1Kb 的片段（如果使用随机引物，将出现多个小片段）。