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BTN71201 柱式动物RNA提取试剂盒
发布时间：2017-09-30 20:39 | 点击次数：215
柱式动物RNA提取试剂盒说明书
产品编号：BTN71201
规格：50T/250T
产品及特点：
本产品是动物总RNA 快速提取试剂动物RNA提取试剂盒（BTN3070）的柱式升级产品，可用于从各种动物组织（包括白细胞）快速提取总RNA。跟动物RNAOUT 相比其主要特点是：
1. 操作更加简单快速，整个过程只需要不到十分钟（对一个样品而言）。
2. RNA 纯度更高，OD260/OD280 一般在2.0 左右。
3. 一般不含用RT-PCR 可以检测到的基因组DNA 污染。
4. 适用于培养细胞、大部分动物组织和部分植物组织。
5. 得到的RNA 可直接用于RT-PCR、Northern 杂交、cDNA 合成等实验。
6. 性价比高于进口的柱式RNA 提取产品。
规格及成分：
保存条件：
常温运输，4℃保存，有效期一年。
自备试剂：
氯仿。
使用方法：
下面的操作步骤是针对在1.5 mL 塑料离心管中进行的微量提取的，如果处理样品量大，请按比例增加各成份的用量并使用大的离心管和离心机。
1. 根据组织细胞类型的不同分为下面及种情况使用：
a) 对贴壁细胞：吸尽培养液，在每10 平方厘米细胞中加入1 mL 溶液A，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。
b) 对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每1-5×106 悬浮细胞中加入1 mL 溶液A，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。如果是fibroblasts或carcinoma cell，1 mL 溶液A 的细胞使用量不要超过1×106个细胞。
c) 对新鲜组织：先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入10 mL 或15 mL 塑料离心管中，每50-100 mg 组织加1 mL 溶液A，用匀浆器匀浆30 秒左右。对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织（细胞中含大量正在复制的DNA），建议组织的使用量不要超过50 mg/ mL 溶液A，否则十分容易产生DNA 污染。
d) 对RNALOCKER 保存组织：先用纸吸去RNALOCKER 液体后再剪切成小块，其余操作同新鲜组织的处理。
2. 将裂解物转移至一个干净的1.5 mL 塑料离心管中，然后加入0.2 倍体积的自备氯仿(1 mL 溶液A 需0.2 ml 氯仿)，振荡器上充分振荡混均30 秒。
3. 12,000 rpm 室温离心3-5 分钟。
4. 将上清液（约0.6-0.8 mL 的无色透明水相，有时水相比重大时，水相在下层，有机相即蓝相在上层，吸取时应吸取透明水相）转移到一个干净的1.5 mL 塑料离心管中。注意：离心后下层有机相和中间层含有DNA 和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和DNA 污染。为保险起见，可以留下100 μL 上清液不取。同时吸取上清时最好缓慢进行，否则容易吸出交界面的不可见的丝状DNA。
5. 加入等体积的溶液B，充分颠倒混匀。
6. 将一半的溶液转移到离心吸附柱中，12,000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液。
7. 将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中，12,000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液。
8. 加0.7 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。一次洗涤一般足够去除杂质。
9. 加0.3 mL 通用洗柱液，室温离心半分钟，弃穿透液。此步可以省略。
10. 室温12,000 rmp 离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响RNA 的使用。
11. 将离心吸附柱转移到一自备的RNase-free 收集管中，加入50-100μL RNA 洗脱液。
12. 室温12,000 rmp 离心半分钟，离心管中溶液即为RNA 样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
13. RNA 的电泳检测：本试剂盒提取的RNA 最好用甲醛变性胶电泳，如果在非变性的普通琼脂糖胶（in TAE 或TBE buffer）上电泳，一定要使用RNA 专用上样液RNAon（操作详见RNAon 使用手册），千万不要使用常用的DNA 上样液，因为DNA 上样液没有经过去RNase 处理，也不能将RNA 变性，得到的带型将十分杂乱。
14. RNA 完整性的电泳检测：如果需要做Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA 电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。
15. RNA 产量产率测定：将5-10 μL RNA 溶于TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），进而计算出RNA 的产量（浓度×体积)和产率(RNA产量/组织用量)。
16. RNA 纯度测定：无污染的总RNA 的OD260/OD280 一般在1.8-2.1 之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR 等反应。
疑难解答：
Q：上样孔里的红色荧光物一定是DNA 污染吗？
A：不是。用TAE 或TBE 电泳液和非变性胶电泳RNA 时容易产生此现象，我们初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链RNA通过碱基互补或通过硼酸络合（如果使用TBE 作电泳液的话）形成的复合物，加RNase 处理后，这些红色荧光物(RNA)一般会消失。为避免此现象，建议最好使用甲醛变性胶电泳和RNA 专用上样液(如RNAon)。
Q：如何确认和去处除污染的基因组DNA？
A：如果怀疑有DNA污染，可以用RNase 处理RNA 样品，然后再电泳。如果上样孔里的红色荧光物不消失，则表示是基因组DNA 污染。进一步确认可以使用PCR 扩增法。去除污染的DNA 可以使用天泽基因的非酶的DNA去除剂DNA Erasol 或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase 一般都有残留的RNase 污染，所以必须严格按照厂家提供的使用说明书进行操作。
产品编号：BTN71201
规格：50T/250T
产品及特点：
本产品是动物总RNA 快速提取试剂动物RNA提取试剂盒（BTN3070）的柱式升级产品，可用于从各种动物组织（包括白细胞）快速提取总RNA。跟动物RNAOUT 相比其主要特点是：
1. 操作更加简单快速，整个过程只需要不到十分钟（对一个样品而言）。
2. RNA 纯度更高，OD260/OD280 一般在2.0 左右。
3. 一般不含用RT-PCR 可以检测到的基因组DNA 污染。
4. 适用于培养细胞、大部分动物组织和部分植物组织。
5. 得到的RNA 可直接用于RT-PCR、Northern 杂交、cDNA 合成等实验。
6. 性价比高于进口的柱式RNA 提取产品。
规格及成分：
| 成分 | 50T | 250T |
| 溶液A | 50ml | 250ml |
| 溶液B | 25ml | 125ml |
| 离心吸附柱 | 50套 | 250套 |
| 通用洗柱液 | 50ml | 250ml |
| RNA 洗脱液 | 10ml | 50ml |
| 说明书 | 1份 | 1份 |
常温运输，4℃保存，有效期一年。
自备试剂：
氯仿。
使用方法：
下面的操作步骤是针对在1.5 mL 塑料离心管中进行的微量提取的，如果处理样品量大，请按比例增加各成份的用量并使用大的离心管和离心机。
1. 根据组织细胞类型的不同分为下面及种情况使用：
a) 对贴壁细胞：吸尽培养液，在每10 平方厘米细胞中加入1 mL 溶液A，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。
b) 对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每1-5×106 悬浮细胞中加入1 mL 溶液A，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。如果是fibroblasts或carcinoma cell，1 mL 溶液A 的细胞使用量不要超过1×106个细胞。
c) 对新鲜组织：先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入10 mL 或15 mL 塑料离心管中，每50-100 mg 组织加1 mL 溶液A，用匀浆器匀浆30 秒左右。对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织（细胞中含大量正在复制的DNA），建议组织的使用量不要超过50 mg/ mL 溶液A，否则十分容易产生DNA 污染。
d) 对RNALOCKER 保存组织：先用纸吸去RNALOCKER 液体后再剪切成小块，其余操作同新鲜组织的处理。
2. 将裂解物转移至一个干净的1.5 mL 塑料离心管中，然后加入0.2 倍体积的自备氯仿(1 mL 溶液A 需0.2 ml 氯仿)，振荡器上充分振荡混均30 秒。
3. 12,000 rpm 室温离心3-5 分钟。
4. 将上清液（约0.6-0.8 mL 的无色透明水相，有时水相比重大时，水相在下层，有机相即蓝相在上层，吸取时应吸取透明水相）转移到一个干净的1.5 mL 塑料离心管中。注意：离心后下层有机相和中间层含有DNA 和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和DNA 污染。为保险起见，可以留下100 μL 上清液不取。同时吸取上清时最好缓慢进行，否则容易吸出交界面的不可见的丝状DNA。
5. 加入等体积的溶液B，充分颠倒混匀。
6. 将一半的溶液转移到离心吸附柱中，12,000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液。
7. 将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中，12,000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液。
8. 加0.7 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。一次洗涤一般足够去除杂质。
9. 加0.3 mL 通用洗柱液，室温离心半分钟，弃穿透液。此步可以省略。
10. 室温12,000 rmp 离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响RNA 的使用。
11. 将离心吸附柱转移到一自备的RNase-free 收集管中，加入50-100μL RNA 洗脱液。
12. 室温12,000 rmp 离心半分钟，离心管中溶液即为RNA 样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
13. RNA 的电泳检测：本试剂盒提取的RNA 最好用甲醛变性胶电泳，如果在非变性的普通琼脂糖胶（in TAE 或TBE buffer）上电泳，一定要使用RNA 专用上样液RNAon（操作详见RNAon 使用手册），千万不要使用常用的DNA 上样液，因为DNA 上样液没有经过去RNase 处理，也不能将RNA 变性，得到的带型将十分杂乱。
14. RNA 完整性的电泳检测：如果需要做Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA 电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。
15. RNA 产量产率测定：将5-10 μL RNA 溶于TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），进而计算出RNA 的产量（浓度×体积)和产率(RNA产量/组织用量)。
16. RNA 纯度测定：无污染的总RNA 的OD260/OD280 一般在1.8-2.1 之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR 等反应。
疑难解答：
Q：上样孔里的红色荧光物一定是DNA 污染吗？
A：不是。用TAE 或TBE 电泳液和非变性胶电泳RNA 时容易产生此现象，我们初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链RNA通过碱基互补或通过硼酸络合（如果使用TBE 作电泳液的话）形成的复合物，加RNase 处理后，这些红色荧光物(RNA)一般会消失。为避免此现象，建议最好使用甲醛变性胶电泳和RNA 专用上样液(如RNAon)。
Q：如何确认和去处除污染的基因组DNA？
A：如果怀疑有DNA污染，可以用RNase 处理RNA 样品，然后再电泳。如果上样孔里的红色荧光物不消失，则表示是基因组DNA 污染。进一步确认可以使用PCR 扩增法。去除污染的DNA 可以使用天泽基因的非酶的DNA去除剂DNA Erasol 或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase 一般都有残留的RNase 污染，所以必须严格按照厂家提供的使用说明书进行操作。