BTN80206 两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)

两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)说明书
产品编号：BTN80206
规格：50T
产品及特点：
本试剂盒是整合cDNA 第一链合成试剂和即用型PCR 试剂而得的RT-PCR 试剂盒。cDNA 第一链合成反应和PCR 反应分别在两个离心管中进行。本试剂盒具有下列特点：
1. 即开即用，足够50 次RT 反应（20 μL 体系）和600 次PCR 反应（30 μL 体系）。
2. cDNA 第一链合成试剂盒可灵活选用随机引物、Oligo dT 引物或基因专一引物，适合各种情况。
3. PCR 试剂盒具有即用、简单等优点，PCR mix 中含上样染料，所以PCR 产物可以直接上样电泳。
4. 两管式操作，RT 和PCR 在不同试管中进行，便于单独优化RT 反应或PCR 反应条件。
5. 扩增效率高, 最长可扩增5 Kbp 以上的RNA。
规格及成分：

成分	规格
MMLV 逆转录酶 (含RI)	100μl
RT Buffer（含dNTP）	300μl
Oligo (dT)18 引物(0.5μg/μL)	50μl
随机引物(0.2 μg/μL)	50μl
RNase-free 水	10ml
PCR MagicMix 3.0	9ml
专用染料	360μl
说明书	1份

保存条件：
低温运输,-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂：
样品RNA、模板专一正向和反向引物。
使用方法：
一、样品RNA 的制备（本试剂盒不提供相关试剂）
1、 可用自本公司各种RNA 提取方法提取样品的RNA，也可以选用其他供应商的产品，但得到的RNA 一定要溶解在RNase-free 的超纯水中。
二：RT（逆转录）反应合成cDNA

• 按下表配制RT 反应体系（20μl体系）:

RNA模板
总RNA                           100-500 ng
或poly(A) mRNA                  10-500 ng
或专一的RNA（如体外转录制备的） 0.01 pg-500 ng
引物
Oligo (dT)18(0.5 μg/μL)               1 μL
或随机引物(0.2 μg/μL)                 1 μL
或自备模板专一反向引物(10 pmol/μL)     1-2 μL
RNase-free 水                           补水到12 μL
注意：RNA 样品不能含有基因组DNA 污染。随机引物与RNA 模板的比例将决定cDNA 合成的平均长度（成反比）。一般情况下随机引物效率好于OligodT 引物，但如果只想转录总RNA 中的mRNA（只占5%左右），则可优先选用OligodT 引物，这样就可以排除非mRNA 的干扰。
2. 70℃保温5 分钟变性模板后立即冰浴。
3. 按顺序加入6 μL RT Buffer（含dNTP）和2 μL MMLV 逆转录酶（含RI），反应终体积为20 μL。
4. 42℃保温60 分钟。此步为RT 反应。
5. 70℃保温10 分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。
6. 合成的cDNA 可以直接作为PCR 模板使用，不需要纯化。剩余样品可以放置在-20℃长期保存。
三、PCR（30 μL 体系）
1、 将全部专用染料加入到PCR MagicMix 3.0 中，轻柔颠倒混匀即可使用。未用完的部分需要在-20℃。也可以不加专用染料，但在PCR 结束后，电泳上样前，则需要加入电泳上样液，否则电泳时没法判断电泳速度。
2、 在PCR 管中加入下列成分：

成份	加入量
PCR MagicMix 3.0（已加染料）	15μl
cDNA 样品（上步的RT 反应液）	1-5μl
模板专一性正向引物(10 pmol/μL)	1-2μl
模板专一性反向引物(10 pmol/μL)	1-2μl
补水到	30μl

注意：cDNA 也可以稀释后用作PCR 模板。是否稀释或稀释多少倍完全取决于靶基因的丰度。

1. PCR 反应参数(需要根据模板和引物决定，下面的只做参考)：

过程	温度	时间
预变性	94℃	5min
PCR 反应 （35 个循环）	94℃	1min
	55℃	1min
	72℃	2min
最后延伸	72℃	10min

四、电泳检测
取5-0 μL PCR 产物直接在PAGE或琼脂糖凝胶上电泳，跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。
注：本试剂盒中的PCR mix含有甘油和染料，可以直接上样，不需要额外再加电泳上样液。