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BTN80804 柱式真菌RNA提取试剂盒
发布时间：2017-09-30 20:45 | 点击次数：252
柱式真菌RNA提取试剂盒说明书
产品编号：BTN80804
规格：50T
产品及特点：
本产品本产品是在本公司真菌RNA提取试剂盒（BTN60305）基础上改进的柱式产品，跟真菌RNA提取试剂盒相比，它具有下列特点：
1. 柱式操作，更加简单快捷，整个过程只需要约 30 分钟。
2. RNA 纯度高，OD260/280 一般都在2.0左右，可直接用于RT-PCR、Norther杂交、microarray hybridization、cDNA 合成等。
3. RNA 产量高，一般在 20-70 μg/mL 酵母培养物(约 2.0 ×107 个细胞)。
4. 非酶细胞破裂法，适用于各种形态和各个种属的真菌及革兰氏阳性细菌，包括 Candida albican、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe 、 Pichia pastoris 、Bacillus subtilis、Staphylococcusaureus 等。
规格及成分：
保存条件：
常温运输，4℃保存，有效期一年。
自备试剂：
氯仿。
使用方法：
1. 将 50 mg 左右的干菌丝(或 100mg左右的鲜菌丝、或适当数量的真菌菌落)转移到 1.5 mL 塑料离心管中。如果是液体真菌培养物，则直接将1-10 mL 液体真菌在 1.5 mL 塑料离心管中 12000-15000 g 离心 1 分钟，并弃尽液体培养基（可以分多次离心）。
2. 加入0.4 mL 溶液 A 并充分吹打混匀。如果 A 溶液存放时产生沉淀，请置于 65℃融化，用前充分摇晃均匀。
3. 加入 0.4 mL 溶液 B，剧烈振荡 30 秒。
4. 65℃保温 5 分钟。
5. 室温 12000-15000 g 离心 3-5 分钟，转移上清到一干净的 1.5 mL 塑料离心管中。
6. 再加入 0.1 mL 溶液B和 0.1mL自备氯仿，振荡混匀 30 秒。
7. 室温 12000-15000 g 离心 3-5 分钟，转移上清到一自备的、干净的 5 mL塑料离心管中。
8. 加入相当于上清 3 倍体积的溶液 C（约1.2-1.5 mL）和1倍体积的溶液 D（约 0.4-0.5 mL），充分混匀。
9. 将 混合 液 （约 2.5mL ）分 3-4 次 转 移 到 离 心 吸 附 柱 中 。 每次13000-15000 g 室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
10. 用 0.5 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
11. 一次洗涤一般足够去除杂质。但如果样品 OD260/280 比值不高，可以再用 0.5 mL 通用洗柱液重复此步一次。
12. 室温离心半分钟。此步十分重要，否则残留的洗柱液会影响 RNA 的使用。
13. 将离心吸附柱转移到一自备的 RNase-free 1.5 mL 塑料离心管中，加入30-100 uL RNA 洗脱液。
14. 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 RNA 样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
15. RNA 完整性的电泳检测：
如果需要做 Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行 RNA 电泳，因为非变性胶不能分离所有的 RNA 分子（BioTechniques，28：414 ， 2000 ）。 如 果 是 简 单 检 测 ， 可 以 使 用 TAE 或 SuperBuffer-2 DNA/RNA 两用快速电泳液，但文献报道必须使用变性上样液（BioTechniques，9:558，1990）。普通 DNA 上样液不含变性剂，也没经过去 RNase 处理，所以最好不要使用。 尤其需要注意的是不要使用 TBE 进行 RNA 电泳，因为 TBE 所含硼酸 是研究多糖的经典方法----硼酸络合法中的关键成分，硼酸通过与 RNA 核糖中的羟基发生络合反应，形成 RNA 分子内或 RNA 分子间的络合复 合物，使同样长度的RNA 具有不同的泳动速度，电泳条带弥散，同时有 大的 RNA 络合复合物迟留在加样孔中（一般会误以为是基因组 DNA污染）。RNA 分子内或RNA 分子间的络合物的形成的多少和比例又与硼酸 与 RNA 的数量比例有关，而 RNA 样品中污染的其他多糖也会参与此反 应，使硼酸对 RNA电泳的影响更复杂，所以 TBE 对 RNA 电泳的影响 没有规律性和重复性。有的样品可以使用有的又不行，最好是避免使用。
16. RNA 产量产率测定：
将 5-10 μL RNA 溶于 TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在 OD260的光吸收。通过光吸收可以得出 RNA 浓度（1 OD260 的 RNA=40μg/mL），进而计算出 RNA 的产量（浓度 X 体积)和产率(RNA 产量/细菌用量)。注意不要将 RNA 稀释在 DEPC 水中检测 OD260 和 OD280，否则光吸收比在 TE 中测得的低 10%-15%。
17. RNA 纯度测定：
无污染的总 RNA 的 OD260/OD280 一般在 1.8-2.1 之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，OD260/OD230 一般在2.0-2.3 之间，如果低于或高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质或多糖的污染，但一般不影响 RT-PCR 等反应。蛋白质污染可以通过酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA 和多糖污染可以分别用我公司的 DNA Erasol 和 PS Erasol 去除。测 OD 时 RNA 不能过度稀释使 OD 读数低于仪器的有效范围。
疑难解答：
Q：为何从酵母中提取的总 RNA 有 3 条小带？
A：它们分别是 70 bp 左右的tRNA, 120 bp左右的 5S RNA, 160 bp 左右的 5.8 S RNA。
Q：上样孔里的红色荧光物一定是污染的基因组 DNA吗？
A：不是。用 TAE 或 TBE 电泳液和非变性胶电泳 RNA 时容易产生此现象，百奥莱博初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链 RNA 通过碱基互补或通过硼酸络合（如果使用 TBE 作电泳液的话）形成的复合物加 RNase 处理后，这些红色荧光物一般会消失。为避免此现象，建议最好使用甲醛变性胶电泳。如果需要使用非变性胶，也必须在上样前使 RNA变性。使用百奥莱博优化的上样/变性/染色三用溶液 RNAON 可以使 RNA在非变性胶上电泳时也有较好分辨率。使用非变性胶时，可以使用 TAE或超快电泳液 SuperBuffer-2，最好不要使用 TBE 缓冲液，因为 TBE 中的硼酸能与 RNA 的多羟基形成复合物，RNA 很难形成锐利的条带。
Q：如何确认和去处除污染的基因组 DNA？
A：如果怀疑有 DNA 污染，可以用 RNase 处理 RNA 样品，然后再电泳。如果上样孔里的红色荧光物不消失，则表示是基因组 DNA 污染。进一步确认可以使用 PCR 扩增法。去除污染的 DNA 可以使用非酶的 DNA 去除剂DNA Erasol 或 RNase-free DNase，由于 RNase-free DNase 一般都有残留的 RNase 污染，所以必须严格按照厂家提供的使用手册进行操作。
产品编号：BTN80804
规格：50T
产品及特点：
本产品本产品是在本公司真菌RNA提取试剂盒（BTN60305）基础上改进的柱式产品，跟真菌RNA提取试剂盒相比，它具有下列特点：
1. 柱式操作，更加简单快捷，整个过程只需要约 30 分钟。
2. RNA 纯度高，OD260/280 一般都在2.0左右，可直接用于RT-PCR、Norther杂交、microarray hybridization、cDNA 合成等。
3. RNA 产量高，一般在 20-70 μg/mL 酵母培养物(约 2.0 ×107 个细胞)。
4. 非酶细胞破裂法，适用于各种形态和各个种属的真菌及革兰氏阳性细菌，包括 Candida albican、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe 、 Pichia pastoris 、Bacillus subtilis、Staphylococcusaureus 等。
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| 溶液A | 20ml |
| 溶液B | 25ml |
| 溶液C | 75ml |
| 溶液D | 25ml |
| 离心吸附柱 | 50套 |
| 通用洗柱液 | 50ml |
| RNA洗脱液 | 10ml |
| 说明书 | 1份 |
常温运输，4℃保存，有效期一年。
自备试剂：
氯仿。
使用方法：
1. 将 50 mg 左右的干菌丝(或 100mg左右的鲜菌丝、或适当数量的真菌菌落)转移到 1.5 mL 塑料离心管中。如果是液体真菌培养物，则直接将1-10 mL 液体真菌在 1.5 mL 塑料离心管中 12000-15000 g 离心 1 分钟，并弃尽液体培养基（可以分多次离心）。
2. 加入0.4 mL 溶液 A 并充分吹打混匀。如果 A 溶液存放时产生沉淀，请置于 65℃融化，用前充分摇晃均匀。
3. 加入 0.4 mL 溶液 B，剧烈振荡 30 秒。
4. 65℃保温 5 分钟。
5. 室温 12000-15000 g 离心 3-5 分钟，转移上清到一干净的 1.5 mL 塑料离心管中。
6. 再加入 0.1 mL 溶液B和 0.1mL自备氯仿，振荡混匀 30 秒。
7. 室温 12000-15000 g 离心 3-5 分钟，转移上清到一自备的、干净的 5 mL塑料离心管中。
8. 加入相当于上清 3 倍体积的溶液 C（约1.2-1.5 mL）和1倍体积的溶液 D（约 0.4-0.5 mL），充分混匀。
9. 将 混合 液 （约 2.5mL ）分 3-4 次 转 移 到 离 心 吸 附 柱 中 。 每次13000-15000 g 室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
10. 用 0.5 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
11. 一次洗涤一般足够去除杂质。但如果样品 OD260/280 比值不高，可以再用 0.5 mL 通用洗柱液重复此步一次。
12. 室温离心半分钟。此步十分重要，否则残留的洗柱液会影响 RNA 的使用。
13. 将离心吸附柱转移到一自备的 RNase-free 1.5 mL 塑料离心管中，加入30-100 uL RNA 洗脱液。
14. 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 RNA 样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
15. RNA 完整性的电泳检测：
如果需要做 Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行 RNA 电泳，因为非变性胶不能分离所有的 RNA 分子（BioTechniques，28：414 ， 2000 ）。 如 果 是 简 单 检 测 ， 可 以 使 用 TAE 或 SuperBuffer-2 DNA/RNA 两用快速电泳液，但文献报道必须使用变性上样液（BioTechniques，9:558，1990）。普通 DNA 上样液不含变性剂，也没经过去 RNase 处理，所以最好不要使用。 尤其需要注意的是不要使用 TBE 进行 RNA 电泳，因为 TBE 所含硼酸 是研究多糖的经典方法----硼酸络合法中的关键成分，硼酸通过与 RNA 核糖中的羟基发生络合反应，形成 RNA 分子内或 RNA 分子间的络合复 合物，使同样长度的RNA 具有不同的泳动速度，电泳条带弥散，同时有 大的 RNA 络合复合物迟留在加样孔中（一般会误以为是基因组 DNA污染）。RNA 分子内或RNA 分子间的络合物的形成的多少和比例又与硼酸 与 RNA 的数量比例有关，而 RNA 样品中污染的其他多糖也会参与此反 应，使硼酸对 RNA电泳的影响更复杂，所以 TBE 对 RNA 电泳的影响 没有规律性和重复性。有的样品可以使用有的又不行，最好是避免使用。
16. RNA 产量产率测定：
将 5-10 μL RNA 溶于 TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在 OD260的光吸收。通过光吸收可以得出 RNA 浓度（1 OD260 的 RNA=40μg/mL），进而计算出 RNA 的产量（浓度 X 体积)和产率(RNA 产量/细菌用量)。注意不要将 RNA 稀释在 DEPC 水中检测 OD260 和 OD280，否则光吸收比在 TE 中测得的低 10%-15%。
17. RNA 纯度测定：
无污染的总 RNA 的 OD260/OD280 一般在 1.8-2.1 之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，OD260/OD230 一般在2.0-2.3 之间，如果低于或高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质或多糖的污染，但一般不影响 RT-PCR 等反应。蛋白质污染可以通过酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA 和多糖污染可以分别用我公司的 DNA Erasol 和 PS Erasol 去除。测 OD 时 RNA 不能过度稀释使 OD 读数低于仪器的有效范围。
疑难解答：
Q：为何从酵母中提取的总 RNA 有 3 条小带？
A：它们分别是 70 bp 左右的tRNA, 120 bp左右的 5S RNA, 160 bp 左右的 5.8 S RNA。
Q：上样孔里的红色荧光物一定是污染的基因组 DNA吗？
A：不是。用 TAE 或 TBE 电泳液和非变性胶电泳 RNA 时容易产生此现象，百奥莱博初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链 RNA 通过碱基互补或通过硼酸络合（如果使用 TBE 作电泳液的话）形成的复合物加 RNase 处理后，这些红色荧光物一般会消失。为避免此现象，建议最好使用甲醛变性胶电泳。如果需要使用非变性胶，也必须在上样前使 RNA变性。使用百奥莱博优化的上样/变性/染色三用溶液 RNAON 可以使 RNA在非变性胶上电泳时也有较好分辨率。使用非变性胶时，可以使用 TAE或超快电泳液 SuperBuffer-2，最好不要使用 TBE 缓冲液，因为 TBE 中的硼酸能与 RNA 的多羟基形成复合物，RNA 很难形成锐利的条带。
Q：如何确认和去处除污染的基因组 DNA？
A：如果怀疑有 DNA 污染，可以用 RNase 处理 RNA 样品，然后再电泳。如果上样孔里的红色荧光物不消失，则表示是基因组 DNA 污染。进一步确认可以使用 PCR 扩增法。去除污染的 DNA 可以使用非酶的 DNA 去除剂DNA Erasol 或 RNase-free DNase，由于 RNase-free DNase 一般都有残留的 RNase 污染，所以必须严格按照厂家提供的使用手册进行操作。