BTN80815 BCA法蛋白定量试剂盒

BCA法蛋白定量试剂盒说明书
产品编号：BTN80815
规格：500T
产品及特点：
本产品是基于BCA 法(bicinchoninic acid，二奎啉甲酸法)蛋白检测原理开发的蛋白质浓度测定产品，BCA 法跟Lowry 法的第一步完全相同，就是在碱性条件下，蓝色的Cu2+被蛋白质还原成紫色的Cu+。此反应类似Cu2+与Biuret(NH2-CO-NH-CO-NH2，双缩尿)发生的反应，故又叫Biuret 反应(Biuret 反应本省就可以测定蛋白质浓度，目前仍然是医院血液蛋白定量的方法)。第二步，Cu+与BCA 发生反应形成水溶性的紫色化合物，通过分光在562nm 处测定紫色化合物的量就可以精确定量蛋白质浓度。BCA 检测灵敏度比Biuret 反应高100 倍左右。
 
此方法的特点如下。
1. 对各种常见的去污剂不敏感，但对Cu 的还原剂和螯合剂比较敏感。
2. 比Lowry 法更加简单快捷，45 分钟内完成测定。
3. 试剂稳定，室温可以放置两年。工作液1 天内有效。
4. 线性范围在 20～2000 μg/mL。如果需要范围在0.1-10ug/mL，需要选用超敏BCA。
5. 最小测量体积为1-20 uL。
6. 终产物稳定，变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。
7. 可以检测最短到双肽，而Bradford法需要一定大小的蛋白质。
8. 有常规(试管)和微量(96 孔板)两种检测模式。
规格及成分：

成分	规格
溶液A	100ml
溶液B	2ml
BSA 标准品(2 mg/mL)	1ml
说明书	1份

保存条件：
常温运输和保存(但BSA 标准品需要-20℃保存)，有效期两年。
自备试剂：
样品缓冲液。
使用方法：
一：96 板操作模式

• 取一块96 孔板，先进行编号(编号可以根据样品数增加)，并按照下表加入BSA 标准，待测样品和溶解待测样品的缓冲液(可以用水替代)：

编号	BSA 标准(2ug/uL)	待测样品(μL)	样品缓冲液(μL)	总体积(μL)	蛋白含量(μg)
0	0	0	20	20	0
1	1	0	19	20	2.0
2	2	0	18	20	4.0
3	4	0	16	20	8.0
4	8	0	12	20	16.0
5	12	0	8	20	24.0
6	16	0	4	20	32.0
7	20	0	0	20	40.0
样品1	0	X	补到20	20	未知
样品N	0	Y	补到20	20	未知

2、 计算BCA 工作液需要量：根据样品数量（包括制备标准曲线的样品的数量）和每个样品需要0.2 mL BCA 工作液的比例，计算所需BCA 工作液的用量，然后加上10%损耗作为实际需要配制的量。例如：计算出需要5mL工作液，实际按不少于5.5 mL 的量配制。
3、 配制BCA 工作液：按50 体积溶液A 加1体积溶液B（50:1）的比例将二者充分混合，所得溶液即BCA 工作液。比如：5 ml 溶液A + 100μl 溶液B。
注意：取用溶液A 和溶液B 前需要充分摇匀，溶液B 非常容易形成沉淀，需要65℃加热溶解后才能使用。当把溶液B 刚加入到溶液A 中时，最初会出现淡绿色沉淀，轻微晃动沉淀即会消失，工作液最后成绿色，可以室温放置12 天，但需要将容器的盖子拧紧。
4、 将10 倍体积（即0.2 mL）的BCA 工作液加入到各孔中并混匀。如果用排枪加入并混匀则更好。也可把96 孔板放在振荡器上振荡30 秒混匀。
5、 37℃放置30 分钟。
6、 冷至室温，10 分钟内完成后续测定，否则化学反应还在继续进行，使光吸收值慢慢升高，每10 分钟会升高2.5%左右。
7、 在562 nm下比色测定样品的光吸收。如酶标仪没有562 nm的设定，可用接近的波长检测，如570nm。
8、 将编号为0号的样品（对照）的读数从其余所有样品（包括0 号样品，其读数变成零）中扣除。
9、 以0-7 号样品的BSA 含量（μg，见上表最右行）为横坐标，以样品的吸光值为纵坐标，绘出BSA 的标准曲线。
10、再将待测样品的吸光值（减去0 号样品的读数后的值）标在标准曲线上，其在横坐标上对应的蛋白含量（μg）就是待测样品中的蛋白质含量，除以样品稀释液总体积（20 μL），乘以样品稀释倍数即为样品浓度（μg/μL）。
二：试管测定模式
1、 基本操作同上，只是操作改在编号的玻璃试管中进行，同时BSA 标准品（2ug/uL）的使用量从低到高改为0、5、10、20、40、60、80、100uL，样品的总体积从20uL 改为100uL，BCA 工作液的用量从每个样品0.2mL 改为2 mL。
三：注意事项
1、 BCA 法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。所以，如果蛋白质浓度较低，可以改在60℃孵育30 分钟或更长。
2、 待测样品浓度在20～2000 微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。
3、 在一定浓度范围内BCA 法测定蛋白浓度不受下列化学物质的影响：

名称	在此浓度下不受影响
Ammonium Sulfate	1.5 M
Brij-35	5.0%
CHAPS	5.0%
EDTA	10 mM
Hepes	100 mM
Glycine, pH 2.8	100 mM
Guanidine HCl	4.0 M
Tween 20、60、80	5.0%
SDS	5.0%
Sodium Acetate pH 5.5	200 mM
Sodium Chloride (NaCl)	1.0 M
Sucrose	40%
Sodium Hydroxide (NaOH)	0.1 M
NP-40	5.0%
Triton X-100	5.0%
Urea	3.0 M

4、 本方法受样品中螯合剂和还原剂的影响，所以需确保EDTA 浓度不高于10mM，二硫苏糖醇不高于1mM，β-巯基乙醇不高于1mM，没有任何EGTA，否则建议使用Bradford 蛋白浓度测定试剂盒（BTN80815）。