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BTN80908 一站式动物mRNA提取试剂盒
发布时间：2017-09-30 21:01 | 点击次数：208
一站式动物mRNA提取试剂盒说明书
产品编号：BTN80908
规格：25T
产品及特点：
构建cDNA 文库、蛋白质的体外翻译和RT-PCR 方法检测稀有的mRNA 等研究常常需要从总RNA 中分离mRNA，mRNA 只占总RNA 的1%左右，但由于带poly（A）尾巴，所以可以通过与Oligo（dT）纤维素的亲和结合而与其他RNA（如rRNA、tRNA 等）分离开。本产品专门用于从动物组织中提取mRNA，它具有下列特点：
1. 一站式，由柱式动物RNA提取试剂和mRNA提取试剂两个产品整合而成，即开即用，非常方便。
2. 一次可以处理50-100mg的动物组织，能得到约10-15μg总RNA，从中可得0.1-0.5μg左右的mRNA。
3. Oligo（dT）纤维素吸附能力强，每克可以吸附50-80 OD 的mRNA，相当于2000-3000 μg mRNA。
4. mRNA 提取过程操作简单，只需要离心就可以完成，免去了常规的灌柱、洗柱等繁琐操作。
5. 得到的mRNA 可以直接用于构建cDNA文库、蛋白质的体外翻译和RT-PCR。
规格及成分：
保存条件：
常温运输， Oligo(dT)纤维素最好-20℃保存，RNA 洗液4℃保存，其余产品可以室温放置。本产品有效期一年。
自备试剂：
氯仿、75%乙醇。
使用方法：
一：用柱式动物RNA提取试剂盒提取总RNA
下面的操作步骤是针对在1.5 mL 塑料离心管中进行的微量提取的，如果处理样品量大，请按比例增加各成份的用量并使用大的离心管和离心机。
1. 新鲜配制裂解液。将溶液A 和溶液B 按1:1 的比例混合，然后根据组织细胞类型的不同分为下面及种情况使用。注意：溶液A 和溶液B 混合后必须立即使用，不要放置，否则会产生沉淀。
a) 对贴壁细胞：吸尽培养液，在每10 平方厘米细胞中加入1 mL 新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。
b) 对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每1-5×106悬浮细胞中加入1mL新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。如果是fibroblasts 或carcinoma cell，1 mL 新鲜配制的裂解液的细胞使用量不要超过1×106个细胞。
c) 对新鲜组织：先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入10 mL 或15 mL 塑料离心管中，每50-100 mg 组织加1 mL 新鲜配制的裂解液，用匀浆器匀浆30 秒左右。对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织（细胞中含大量正在复制的DNA），建议组织的使用量不要超过50mg/mL裂解液，否则十分容易产生DNA污染。
d) 对RNALOCKER 保存组织：先用纸吸去RNALOCKER 液体后再剪切成小块，其余操作同新鲜组织的处理。
2. 将裂解物转移至一个干净的1.5 mL 塑料离心管中，然后加入0.2 倍体积的自备氯仿(1 mL 裂解物需0.2 ml 氯仿)，振荡器上充分振荡混均30 秒。
3. 12000-15000 g 室温离心3-5 分钟。
4. 将上清液（约0.6-0.8 mL）转移到离心吸附柱中。注意：离心后下层有机相和中间层含有DNA 和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和DNA 污染。为保险起见，可以留下100 μL 上清液不取。同时吸取上清时最好缓慢进行，否则容易吸出交界面的不可见的丝状DNA。
5. 13000-15000 g 室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
6. 加0.5 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
7. 再加0.5 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
8. 室温离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响RNA 的使用。
9. 将离心吸附柱转移到一自备的RNase-free 收集管中，加入50 μL RNA 洗脱液。
10. 室温离心半分钟，离心管中溶液即为RNA 样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
11. RNA 完整性的电泳检测：如果需要做Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA 电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。
12. RNA 产量产率测定：将5-10 μL RNA 溶于TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在OD260 的光吸收。通过光吸收可以得出RNA 浓度（1 OD260 的RNA=40 μg/mL），进而计算出RNA 的产量（浓度X 体积)和产率(RNA 产量/组织用量)。
13. RNA 纯度测定：无污染的总RNA 的OD260/OD280 一般在1.8-2.1 之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR 等反应。
二：从总RNA 中提取mRNA
本产品提供本产品提供25 mg Oligo(dT)纤维素，每克Oligo(dT)纤维素能够结合50-80 OD 的mRNA。
1. 在一个1.5 mL 塑料离心管中称取1 mg Oligo (dT)纤维素。将0.5 mL 结合液加入到一管装有1 mg Oligo (dT)纤维素的离心管中，混匀后室温放置5分钟。也可以将250 μL 结合液加入到装有25 mg Oligo(dT)纤维素的离心管中，每次取10 μL（相当于1 mg Oligo (dT)纤维素）与0.5 mL 结合液混匀，室温放置5 分钟。剩余部分放-80℃保存。
2. 200-2000 g 离心30 秒，小心吸弃上清后留Oligo (dT)纤维素沉淀待用。
3. 将在第一节中提取的两管相同的总RNA（每个样品用50 μL 洗脱）混合在一起得到总RNA 100 μL，65℃加热 5 分钟。
4. 加入等体积的结合液，混匀后冷却到室温后，全部转移到装有Oligo(dT)纤维素的离心管中。
5. 混匀后室温放置5 分钟，期间颠倒混匀数次。
6. 4℃ 200-2000g 离心5 分钟，小心将上清转移到一个离心管中。此上清液是去除了mRNA 的总RNA。冰上放置待用。
7. 加入0.5 mL 结合液，混匀后4℃ 200-2000g 离心5 分钟，小心弃上清。
8. 重复上步2-4 次。
9. 加入50 μL RNA 洗脱液，混匀后4℃ 200-2000g 离心5 分钟，小心收集上清（mRNA）。
10. 重复上步1-3 次。
11. 将各次收集的mRNA 混合。
三：用微量核酸沉淀剂沉淀mRNA
1. 按2:1 的比例将微量核酸沉淀剂与mRNA 溶液混合。微量核酸沉淀剂用前需要摇匀。
2. 室温15000 g 离心10 分钟(如果mRNA 含量在2 ng 以下，建议离心30分钟)。
3. 小心弃上清后，加入1 mL 自备的75%乙醇，振荡混匀。
4. 15000 离心3-5 分钟，小心弃上清。
5. 再短暂离心后小心吸弃上清，沉淀即为回收的mRNA 沉淀，可溶于TE 或RNA 洗脱液中待用。
产品编号：BTN80908
规格：25T
产品及特点：
构建cDNA 文库、蛋白质的体外翻译和RT-PCR 方法检测稀有的mRNA 等研究常常需要从总RNA 中分离mRNA，mRNA 只占总RNA 的1%左右，但由于带poly（A）尾巴，所以可以通过与Oligo（dT）纤维素的亲和结合而与其他RNA（如rRNA、tRNA 等）分离开。本产品专门用于从动物组织中提取mRNA，它具有下列特点：
1. 一站式，由柱式动物RNA提取试剂和mRNA提取试剂两个产品整合而成，即开即用，非常方便。
2. 一次可以处理50-100mg的动物组织，能得到约10-15μg总RNA，从中可得0.1-0.5μg左右的mRNA。
3. Oligo（dT）纤维素吸附能力强，每克可以吸附50-80 OD 的mRNA，相当于2000-3000 μg mRNA。
4. mRNA 提取过程操作简单，只需要离心就可以完成，免去了常规的灌柱、洗柱等繁琐操作。
5. 得到的mRNA 可以直接用于构建cDNA文库、蛋白质的体外翻译和RT-PCR。
规格及成分：
| 成分 | 规格 | |
| 柱式动物RNA提取试剂 | 溶液A | 25ml |
| 溶液B | 25ml | |
| 离心吸附柱 | 50套 | |
| 通用洗柱液 | 50ml | |
| RNA洗脱液 | 5ml | |
| mRNA提取试剂 | 结合液 | 100ml |
| Oligo(dT)纤维素 | 25mg | |
| RNA 洗脱液 | 5ml | |
| 微量核酸沉淀剂 | 微量核酸沉淀剂 | 10ml |
常温运输， Oligo(dT)纤维素最好-20℃保存，RNA 洗液4℃保存，其余产品可以室温放置。本产品有效期一年。
自备试剂：
氯仿、75%乙醇。
使用方法：
一：用柱式动物RNA提取试剂盒提取总RNA
下面的操作步骤是针对在1.5 mL 塑料离心管中进行的微量提取的，如果处理样品量大，请按比例增加各成份的用量并使用大的离心管和离心机。
1. 新鲜配制裂解液。将溶液A 和溶液B 按1:1 的比例混合，然后根据组织细胞类型的不同分为下面及种情况使用。注意：溶液A 和溶液B 混合后必须立即使用，不要放置，否则会产生沉淀。
a) 对贴壁细胞：吸尽培养液，在每10 平方厘米细胞中加入1 mL 新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。
b) 对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每1-5×106悬浮细胞中加入1mL新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。如果是fibroblasts 或carcinoma cell，1 mL 新鲜配制的裂解液的细胞使用量不要超过1×106个细胞。
c) 对新鲜组织：先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入10 mL 或15 mL 塑料离心管中，每50-100 mg 组织加1 mL 新鲜配制的裂解液，用匀浆器匀浆30 秒左右。对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织（细胞中含大量正在复制的DNA），建议组织的使用量不要超过50mg/mL裂解液，否则十分容易产生DNA污染。
d) 对RNALOCKER 保存组织：先用纸吸去RNALOCKER 液体后再剪切成小块，其余操作同新鲜组织的处理。
2. 将裂解物转移至一个干净的1.5 mL 塑料离心管中，然后加入0.2 倍体积的自备氯仿(1 mL 裂解物需0.2 ml 氯仿)，振荡器上充分振荡混均30 秒。
3. 12000-15000 g 室温离心3-5 分钟。
4. 将上清液（约0.6-0.8 mL）转移到离心吸附柱中。注意：离心后下层有机相和中间层含有DNA 和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和DNA 污染。为保险起见，可以留下100 μL 上清液不取。同时吸取上清时最好缓慢进行，否则容易吸出交界面的不可见的丝状DNA。
5. 13000-15000 g 室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
6. 加0.5 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
7. 再加0.5 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
8. 室温离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响RNA 的使用。
9. 将离心吸附柱转移到一自备的RNase-free 收集管中，加入50 μL RNA 洗脱液。
10. 室温离心半分钟，离心管中溶液即为RNA 样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
11. RNA 完整性的电泳检测：如果需要做Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA 电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。
12. RNA 产量产率测定：将5-10 μL RNA 溶于TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在OD260 的光吸收。通过光吸收可以得出RNA 浓度（1 OD260 的RNA=40 μg/mL），进而计算出RNA 的产量（浓度X 体积)和产率(RNA 产量/组织用量)。
13. RNA 纯度测定：无污染的总RNA 的OD260/OD280 一般在1.8-2.1 之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR 等反应。
二：从总RNA 中提取mRNA
本产品提供本产品提供25 mg Oligo(dT)纤维素，每克Oligo(dT)纤维素能够结合50-80 OD 的mRNA。
1. 在一个1.5 mL 塑料离心管中称取1 mg Oligo (dT)纤维素。将0.5 mL 结合液加入到一管装有1 mg Oligo (dT)纤维素的离心管中，混匀后室温放置5分钟。也可以将250 μL 结合液加入到装有25 mg Oligo(dT)纤维素的离心管中，每次取10 μL（相当于1 mg Oligo (dT)纤维素）与0.5 mL 结合液混匀，室温放置5 分钟。剩余部分放-80℃保存。
2. 200-2000 g 离心30 秒，小心吸弃上清后留Oligo (dT)纤维素沉淀待用。
3. 将在第一节中提取的两管相同的总RNA（每个样品用50 μL 洗脱）混合在一起得到总RNA 100 μL，65℃加热 5 分钟。
4. 加入等体积的结合液，混匀后冷却到室温后，全部转移到装有Oligo(dT)纤维素的离心管中。
5. 混匀后室温放置5 分钟，期间颠倒混匀数次。
6. 4℃ 200-2000g 离心5 分钟，小心将上清转移到一个离心管中。此上清液是去除了mRNA 的总RNA。冰上放置待用。
7. 加入0.5 mL 结合液，混匀后4℃ 200-2000g 离心5 分钟，小心弃上清。
8. 重复上步2-4 次。
9. 加入50 μL RNA 洗脱液，混匀后4℃ 200-2000g 离心5 分钟，小心收集上清（mRNA）。
10. 重复上步1-3 次。
11. 将各次收集的mRNA 混合。
三：用微量核酸沉淀剂沉淀mRNA
1. 按2:1 的比例将微量核酸沉淀剂与mRNA 溶液混合。微量核酸沉淀剂用前需要摇匀。
2. 室温15000 g 离心10 分钟(如果mRNA 含量在2 ng 以下，建议离心30分钟)。
3. 小心弃上清后，加入1 mL 自备的75%乙醇，振荡混匀。
4. 15000 离心3-5 分钟，小心弃上清。
5. 再短暂离心后小心吸弃上清，沉淀即为回收的mRNA 沉淀，可溶于TE 或RNA 洗脱液中待用。