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BTN80928 大提柱式土壤DNA提取试剂盒
发布时间：2017-09-30 21:06 | 点击次数：346
大提柱式土壤DNA提取试剂盒说明书
产品编号：BTN80928
规格：4T
产品及特点：
本产品是在柱式土壤DNA提取试剂盒基础上开发而得的大提升级产品，用于从各种土壤样品和河海沉积物中大量提取高质量的DNA的试剂。跟柱式土壤DNA提取试剂盒相比它具有下列特点：
1.处理量大，一次最多可以处理20克的土壤样品。
2.去污染效果更好，得到的 DNA 可以直接作为 PCR 模板或酶切，不需要再进行去腐殖酸处理。
3.操作过程更加简单快速，整个操作只需要10多分钟，扩容性好。
4.产量高，每克土壤一般可以提取到 5-50μg DNA，片段长度在 20-50 Kb，OD260/280 一般都在1.8以上。
5.适合于各种土壤（包括河海沉积物）。
规格及成分：
保存条件：
常温运输，4℃保存，保存期为一年。
自备试剂：
氯仿
使用方法：
1.65℃预热溶液 A，待其沉淀溶化后充分混匀，取 10 mL 加入到 1.5 mL塑料离心管中并放置于 65℃待用。
2.称取 3-20 g 的土壤，加入到含预热溶液 A 的离心管中，震荡器上剧烈震荡 5-10 分钟。
3.将离心管置于 65℃水浴中保温至少 5 分钟。
4.5000-7000 rpm 室温离心 3-5 分钟，将上清转移到一新离心管中(上清液一般呈淡黄色或深棕色，实际颜色取决于腐殖酸的含量，上清液的体积
一般为 6-8 mL)。
5.在上清液中加入等体积的溶液 B，上下颠倒 30 秒充分混匀，溶液将呈白色或淡黄色混浊状。
6.将离心管冰浴至少 5 分钟。
7. 5000-7000 rpm 室温离心 3-5 分钟，转移上清到新的 50 mL 离心管中，上清液颜色将比第 4 步得到的上清的颜色稍淡，体积在 14 mL 左右。
注意：下面第 8-第 9 步的氯仿抽提操作可以省略，直接进入第 10 步，但 DNA的产量会低 50%左右，OD260/280 在 1.7-1.8。
8. 加入 4 mL 的氯仿(自备)，震荡器上充分振荡 30 秒混匀。注意:一定要让管底的溶液震荡起来。
9. 5000-7000 rpm 室温离心 3-5 分钟，小心转移上清到新离心管中，体积在 11 mL 左右。说明：离心后两相交界面将有白色膜状物，其中有机相部分颜色较深，一般呈淡棕色。上清的颜色取决于土壤中腐殖酸的含量。
10. 加入 1.5 倍体积的溶液 C，上下颠倒 30 秒混匀。
11. 分两次上柱（即先转移一半的混合液到离心吸附柱中，5000-7000 rpm室温离心 1 分钟，弃穿透液，然后再将剩下的混合液到离心吸附柱中，5000-7000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液）。
12. 加 10 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，5000-7000 rpm 室温离心1分钟，弃穿透液。
13. 重复上个步骤一次。
14. 5000-7000 rpm 室温再离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会污染 DNA。
15. 将离心吸附柱转移到一新的 50 mL 塑料离心管中，加入1mL通用洗脱液。
16. 室温放置离心吸附柱 1-2 分钟。
17. 5000-7000 rpm 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 DNA 样品。
疑难解答：
Q: 如何判断提取的ＤＮＡ没有腐植酸污染？
A：方法一是目测法，即看得到的溶液是否无色。如果呈淡棕黑色或淡黄色，说明可能是少量残留的未除尽的腐植酸。方法二是检测最大光吸收。注意：有腐植酸污染并不表示 DNA 不能使用，有的腐殖酸并不抑制 PCR 扩增。
Q: 腐殖酸的最大吸收波长是多少？
A：腐植酸（humic acid）是一大类呈棕黑色或黑色的物质，其结构千差万别，土壤中腐殖酸的组成和特点随土壤不同而不同，所以其最大吸收波长也各不相同，有的土壤的腐殖酸在 260 nm 有最大吸收（见 Appl.Environ.Microbiol., 63：4993，1997），有的则在 340 nm。所以用特定的波长测定 OD 值时波长的选定要根据土壤而决定。Sigma, Fluke 等公司出售的腐植酸产品成分一般比较简单，其最大吸收波长不能推广到成分更为复杂 的土壤腐殖酸样品。
Q: 是否腐植酸都会抑制后续的 DNA 反应？
A：否，因为腐植酸是一大类物质的统称，他们的结构和特性各不相同，所以 是否对后续反应有影响最好通过实验来验证。如果用提取的 DNA 溶液原 液进行反应而反应没发生，而对照样品（已知的不含污染的 DNA）能够发 生，说明可能抑制作用。
Q：如果得到的 DNA 样品还是含有抑制后续反应的腐植酸，如何去除？
A：如果提取的 DNA 原液不能扩增，可以将样品稀释 10 倍和 100 倍再进行 PCR，抑制作用一般可以解除。如果仍然抑制，可以使用我公司的 PCR Inhibitor Erasol（BTN60804）。如果仍然不能解除，则可以通过柱 式腐殖酸清除剂（BTN60801）或先电泳，再用超大片段胶回收试剂 Magic Gel DNABACK（BTN60706）纯化土壤 DNA，去除残留抑制 剂。其中后两方法最有效，得到的原液一般可以直接扩增。
Q：在用土壤 DNA 进行细菌专一性 PCR 时，为何没加 DNA 模版的阴性对照 有扩增产物出现？
A：这是由于使用的 Taq DNA 聚合酶一般从 E.coli 表达菌株中提取，提取过 程中污染了 E.coli 的基因组 DNA，而使用的广谱细菌专一性引物可以识别所有细菌 DNA 基因组 DNA 模版，所以会产生扩增。建议使用高质量 的 Taq DNA 聚合酶。
产品编号：BTN80928
规格：4T
产品及特点：
本产品是在柱式土壤DNA提取试剂盒基础上开发而得的大提升级产品，用于从各种土壤样品和河海沉积物中大量提取高质量的DNA的试剂。跟柱式土壤DNA提取试剂盒相比它具有下列特点：
1.处理量大，一次最多可以处理20克的土壤样品。
2.去污染效果更好，得到的 DNA 可以直接作为 PCR 模板或酶切，不需要再进行去腐殖酸处理。
3.操作过程更加简单快速，整个操作只需要10多分钟，扩容性好。
4.产量高，每克土壤一般可以提取到 5-50μg DNA，片段长度在 20-50 Kb，OD260/280 一般都在1.8以上。
5.适合于各种土壤（包括河海沉积物）。
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| 溶液A | 50ml |
| 溶液B | 50ml |
| 溶液C | 100ml |
| 离心吸附柱 | 4套 |
| 通用洗柱液 | 100ml |
| 通用洗脱液 | 10ml |
| 说明书 | 1份 |
常温运输，4℃保存，保存期为一年。
自备试剂：
氯仿
使用方法：
1.65℃预热溶液 A，待其沉淀溶化后充分混匀，取 10 mL 加入到 1.5 mL塑料离心管中并放置于 65℃待用。
2.称取 3-20 g 的土壤，加入到含预热溶液 A 的离心管中，震荡器上剧烈震荡 5-10 分钟。
3.将离心管置于 65℃水浴中保温至少 5 分钟。
4.5000-7000 rpm 室温离心 3-5 分钟，将上清转移到一新离心管中(上清液一般呈淡黄色或深棕色，实际颜色取决于腐殖酸的含量，上清液的体积
一般为 6-8 mL)。
5.在上清液中加入等体积的溶液 B，上下颠倒 30 秒充分混匀，溶液将呈白色或淡黄色混浊状。
6.将离心管冰浴至少 5 分钟。
7. 5000-7000 rpm 室温离心 3-5 分钟，转移上清到新的 50 mL 离心管中，上清液颜色将比第 4 步得到的上清的颜色稍淡，体积在 14 mL 左右。
注意：下面第 8-第 9 步的氯仿抽提操作可以省略，直接进入第 10 步，但 DNA的产量会低 50%左右，OD260/280 在 1.7-1.8。
8. 加入 4 mL 的氯仿(自备)，震荡器上充分振荡 30 秒混匀。注意:一定要让管底的溶液震荡起来。
9. 5000-7000 rpm 室温离心 3-5 分钟，小心转移上清到新离心管中，体积在 11 mL 左右。说明：离心后两相交界面将有白色膜状物，其中有机相部分颜色较深，一般呈淡棕色。上清的颜色取决于土壤中腐殖酸的含量。
10. 加入 1.5 倍体积的溶液 C，上下颠倒 30 秒混匀。
11. 分两次上柱（即先转移一半的混合液到离心吸附柱中，5000-7000 rpm室温离心 1 分钟，弃穿透液，然后再将剩下的混合液到离心吸附柱中，5000-7000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液）。
12. 加 10 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，5000-7000 rpm 室温离心1分钟，弃穿透液。
13. 重复上个步骤一次。
14. 5000-7000 rpm 室温再离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会污染 DNA。
15. 将离心吸附柱转移到一新的 50 mL 塑料离心管中，加入1mL通用洗脱液。
16. 室温放置离心吸附柱 1-2 分钟。
17. 5000-7000 rpm 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 DNA 样品。
疑难解答：
Q: 如何判断提取的ＤＮＡ没有腐植酸污染？
A：方法一是目测法，即看得到的溶液是否无色。如果呈淡棕黑色或淡黄色，说明可能是少量残留的未除尽的腐植酸。方法二是检测最大光吸收。注意：有腐植酸污染并不表示 DNA 不能使用，有的腐殖酸并不抑制 PCR 扩增。
Q: 腐殖酸的最大吸收波长是多少？
A：腐植酸（humic acid）是一大类呈棕黑色或黑色的物质，其结构千差万别，土壤中腐殖酸的组成和特点随土壤不同而不同，所以其最大吸收波长也各不相同，有的土壤的腐殖酸在 260 nm 有最大吸收（见 Appl.Environ.Microbiol., 63：4993，1997），有的则在 340 nm。所以用特定的波长测定 OD 值时波长的选定要根据土壤而决定。Sigma, Fluke 等公司出售的腐植酸产品成分一般比较简单，其最大吸收波长不能推广到成分更为复杂 的土壤腐殖酸样品。
Q: 是否腐植酸都会抑制后续的 DNA 反应？
A：否，因为腐植酸是一大类物质的统称，他们的结构和特性各不相同，所以 是否对后续反应有影响最好通过实验来验证。如果用提取的 DNA 溶液原 液进行反应而反应没发生，而对照样品（已知的不含污染的 DNA）能够发 生，说明可能抑制作用。
Q：如果得到的 DNA 样品还是含有抑制后续反应的腐植酸，如何去除？
A：如果提取的 DNA 原液不能扩增，可以将样品稀释 10 倍和 100 倍再进行 PCR，抑制作用一般可以解除。如果仍然抑制，可以使用我公司的 PCR Inhibitor Erasol（BTN60804）。如果仍然不能解除，则可以通过柱 式腐殖酸清除剂（BTN60801）或先电泳，再用超大片段胶回收试剂 Magic Gel DNABACK（BTN60706）纯化土壤 DNA，去除残留抑制 剂。其中后两方法最有效，得到的原液一般可以直接扩增。
Q：在用土壤 DNA 进行细菌专一性 PCR 时，为何没加 DNA 模版的阴性对照 有扩增产物出现？
A：这是由于使用的 Taq DNA 聚合酶一般从 E.coli 表达菌株中提取，提取过 程中污染了 E.coli 的基因组 DNA，而使用的广谱细菌专一性引物可以识别所有细菌 DNA 基因组 DNA 模版，所以会产生扩增。建议使用高质量 的 Taq DNA 聚合酶。