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BTN81028 一站式植物mRNA提取试剂盒
发布时间：2017-10-01 08:14 | 点击次数：215
一站式植物mRNA提取试剂盒说明书
产品编号：BTN81028
规格：25T
产品及特点：
构建 cDNA 文库、蛋白质的体外翻译和 RT-PCR 方法检测稀有的 mRNA等研究常常需要从总 RNA 中分离 mRNA，mRNA 只占总 RNA 的 1%左右，但由于带 Poly（A）尾巴，所以可以通过与 Oligo（dT）纤维素的亲和结合而与其他 RNA（如 rRNA、tRNA 等）分离开。本产品专门用于从植物组织中一站式提取 mRNA，它具有下列特点：
1. 一站式，是有百奥莱博的高效、无多糖柱式植物 RNA 提取试剂和mRNA 提取试剂两个产品整合而成，即开即用，非常方便。
2. 一次可以处理 50-500mg的植物组织，能得到约10-15μg总RNA，从中可得0.1-0.5μg左右的 mRNA。
3. Oligo（dT）纤维素吸附能力强，每克可以吸附50-80OD的mRNA，相当于2000-3000μg mRNA。
4. mRNA 的操作过程简单，只需要离心就可以完成，免去了常规的灌柱、洗柱等繁琐操作。
5. 得到的 mRNA 可以直接用于构建 cDNA 文库、蛋白质的体外翻译和RT-PCR。
规格及成分：
保存条件：
常温运输，4℃保存，Oligo（dT）纤维素低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
氯仿，RNase-free 收集管。
使用方法：
第一步，用植物RNA提取试剂盒的方法提取植物总RNA，最后用50μL洗脱，将两管收集在一起，共得到100μL总RNA（详细操作见下）：
1. 估算植物组织细胞的用量。每次微量提取一般需要100-200mg 植物叶片或50-100mg植物种子或 200-500mg植物果实。
2. 先将新鲜植物组织剪切成小块(保存在 RNALOCKER 中的植物组织需用纸吸去 RNALOCKER 液体后再剪切成小块)，放入 10-15 mL 塑料离心管中，加入 1 mL 溶液 A，然后用匀浆器匀浆 5-20 秒。匀浆时会产生泡沫，但不影响提取效果。也可以使用液氮砚磨法破碎植物组织，砚磨完后加入 1 mL溶液 A。注意：溶解溶液 A 沉淀。溶液A在 4℃放置后可能会产生沉淀，使用前必须放在 65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用。
3. 将匀浆物或砚磨物转移至干净的 1.5 mL 塑料离心管中(可以不必转移非液体的细胞碎片)。有的植物组织（比如果实）含有大量水份，匀浆液会多于 1 mL，转移时也只取 1 mL。
4. 在离心管中加入 0.3 mL 的溶液 B 和 0.2 mL 自备氯仿，在振荡器上振荡30 秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。
5. 室温 12000 rpm 离心 3-5 分钟，两相间将有约 5-10 毫米厚的细胞破碎物。
6. 将上清液(约 0.6 mL)转移到另一干净的 1.5 mL 塑料离心管中，下层有机相和中间层含有 DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。最好留下100 μL 上清液不取。
7. 加入等体积的溶液 C，充分颠倒混匀。
8. 将一半的溶液转移到离心吸附柱(60911B)中，12000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液。
9. 将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中， 12000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液。
10. 加 0.7 mL 通用洗柱液，室温离心半分钟，弃穿透液。
11. 加 0.3 mL 通用洗柱液，室温离心半分钟，弃穿透液。此步可以省略。
12. 室温离心半分钟。此步十分重要，否则残留的乙醇会影响 RNA 的使用。
13. 将离心吸附柱转移到 RNase-free 收集管中，加入 50-100 μL RNA 洗脱液，室温放置 1-2 分钟。
14. 12000 rpm 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 RNA 样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
第二步，从总 RNA 中纯化 mRNA（详细操作见下）：
本产品提供本产品提供 25 mg Oligo(dT)纤维素，每克 Oligo(dT)纤维素能够结合 50-80 OD 的 mRNA。
1. 在一个 1.5 mL 塑料离心管中称取 1 mg Oligo (dT)纤维素。将 0.5 mL结合液加入到一管装有 1 mg Oligo (dT)纤维素的离心管中，混匀后室温放置 5 分钟。也可以将 250 μL 结合液加入到装有 25 mg Oligo(dT)纤维素的离心管中，每次取 10 μL、相当于 1 mg Oligo (dT)纤维素、与 0.5mL 结合液混匀，室温放置 5 分钟。剩余部分放-80℃保存。
2. 200-1000 g 离心30秒，小心吸弃上清后留 Oligo (dT)纤维素沉淀待用。
3. 将第一步制备的总RNA 100μL（如果体积不足100μL，用水补足），65℃加热5分钟。
4. 加入等体积的结合液，混匀后冷却到室温后，全部转移到装有 Oligo(dT)纤维素的离心管中。
5. 混匀后室温放置5分钟，期间颠倒混匀数次。
6. 4℃ 200-1000g离心5分钟，小心将上清转移到一个离心管中。此上清液是去除了mRNA的总RNA。可以冰箱保存作为阴性对照。
7. 加入 0.5 mL 结合液，混匀后 4℃ 200-1000 g 离心 5 分钟，小心弃上清。
8. 重复上步 2-4 次。
9. 加入 50 μL RNA 洗脱液，混匀后 4℃ 200-1000 g 离心 5 分钟，小心收集上清（mRNA）。
10. 重复上步 1-3 次。
11. 将各次收集的 mRNA 混合，即为 mRNA 溶液。此溶液可以直接使用。如果太稀，可以按第三步方法浓缩。
第三步，用微量核酸沉淀剂沉淀 mRNA（详细操作见下）：
1. 按 2:1 的比例将本产品与第三步得到的 mRNA 溶液混合。注意：微量核酸沉淀剂有不溶的核酸助沉剂，所以用前需要摇匀以便所取的部分含有一定量的核酸助沉剂。
2. 室温 15000 g 离心 10 分钟(如果核酸含量在 2 ng 以下，建议离心 30 分钟)。
3. 弃上清后加 75%乙醇 1 mL，振荡混匀。
4. 15000 离心 3-5 分钟，弃上清。
5. 再短暂离心后小心吸弃上清，沉淀即为回收的 mRNA 沉淀，可溶于 DEPC水中直接使用或放-70℃长期保存。
产品编号：BTN81028
规格：25T
产品及特点：
构建 cDNA 文库、蛋白质的体外翻译和 RT-PCR 方法检测稀有的 mRNA等研究常常需要从总 RNA 中分离 mRNA，mRNA 只占总 RNA 的 1%左右，但由于带 Poly（A）尾巴，所以可以通过与 Oligo（dT）纤维素的亲和结合而与其他 RNA（如 rRNA、tRNA 等）分离开。本产品专门用于从植物组织中一站式提取 mRNA，它具有下列特点：
1. 一站式，是有百奥莱博的高效、无多糖柱式植物 RNA 提取试剂和mRNA 提取试剂两个产品整合而成，即开即用，非常方便。
2. 一次可以处理 50-500mg的植物组织，能得到约10-15μg总RNA，从中可得0.1-0.5μg左右的 mRNA。
3. Oligo（dT）纤维素吸附能力强，每克可以吸附50-80OD的mRNA，相当于2000-3000μg mRNA。
4. mRNA 的操作过程简单，只需要离心就可以完成，免去了常规的灌柱、洗柱等繁琐操作。
5. 得到的 mRNA 可以直接用于构建 cDNA 文库、蛋白质的体外翻译和RT-PCR。
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| 柱式植物RNAout溶液 A | 50ml |
| 柱式植物RNAout溶液 B | 15ml |
| 柱式植物RNAout溶液 C | 50ml |
| 离心吸附柱 | 50套 |
| 通用洗柱液 | 50ml |
| RNA洗脱液 | 10ml |
| 结合液 | 100ml |
| Oligo(dT)纤维素 | 25mg |
| RNase-free水 | 10ml |
| 微量核酸沉淀剂 | 10ml |
| 说明书 | 1份 |
常温运输，4℃保存，Oligo（dT）纤维素低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
氯仿，RNase-free 收集管。
使用方法：
第一步，用植物RNA提取试剂盒的方法提取植物总RNA，最后用50μL洗脱，将两管收集在一起，共得到100μL总RNA（详细操作见下）：
1. 估算植物组织细胞的用量。每次微量提取一般需要100-200mg 植物叶片或50-100mg植物种子或 200-500mg植物果实。
2. 先将新鲜植物组织剪切成小块(保存在 RNALOCKER 中的植物组织需用纸吸去 RNALOCKER 液体后再剪切成小块)，放入 10-15 mL 塑料离心管中，加入 1 mL 溶液 A，然后用匀浆器匀浆 5-20 秒。匀浆时会产生泡沫，但不影响提取效果。也可以使用液氮砚磨法破碎植物组织，砚磨完后加入 1 mL溶液 A。注意：溶解溶液 A 沉淀。溶液A在 4℃放置后可能会产生沉淀，使用前必须放在 65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用。
3. 将匀浆物或砚磨物转移至干净的 1.5 mL 塑料离心管中(可以不必转移非液体的细胞碎片)。有的植物组织（比如果实）含有大量水份，匀浆液会多于 1 mL，转移时也只取 1 mL。
4. 在离心管中加入 0.3 mL 的溶液 B 和 0.2 mL 自备氯仿，在振荡器上振荡30 秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。
5. 室温 12000 rpm 离心 3-5 分钟，两相间将有约 5-10 毫米厚的细胞破碎物。
6. 将上清液(约 0.6 mL)转移到另一干净的 1.5 mL 塑料离心管中，下层有机相和中间层含有 DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。最好留下100 μL 上清液不取。
7. 加入等体积的溶液 C，充分颠倒混匀。
8. 将一半的溶液转移到离心吸附柱(60911B)中，12000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液。
9. 将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中， 12000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液。
10. 加 0.7 mL 通用洗柱液，室温离心半分钟，弃穿透液。
11. 加 0.3 mL 通用洗柱液，室温离心半分钟，弃穿透液。此步可以省略。
12. 室温离心半分钟。此步十分重要，否则残留的乙醇会影响 RNA 的使用。
13. 将离心吸附柱转移到 RNase-free 收集管中，加入 50-100 μL RNA 洗脱液，室温放置 1-2 分钟。
14. 12000 rpm 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 RNA 样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
第二步，从总 RNA 中纯化 mRNA（详细操作见下）：
本产品提供本产品提供 25 mg Oligo(dT)纤维素，每克 Oligo(dT)纤维素能够结合 50-80 OD 的 mRNA。
1. 在一个 1.5 mL 塑料离心管中称取 1 mg Oligo (dT)纤维素。将 0.5 mL结合液加入到一管装有 1 mg Oligo (dT)纤维素的离心管中，混匀后室温放置 5 分钟。也可以将 250 μL 结合液加入到装有 25 mg Oligo(dT)纤维素的离心管中，每次取 10 μL、相当于 1 mg Oligo (dT)纤维素、与 0.5mL 结合液混匀，室温放置 5 分钟。剩余部分放-80℃保存。
2. 200-1000 g 离心30秒，小心吸弃上清后留 Oligo (dT)纤维素沉淀待用。
3. 将第一步制备的总RNA 100μL（如果体积不足100μL，用水补足），65℃加热5分钟。
4. 加入等体积的结合液，混匀后冷却到室温后，全部转移到装有 Oligo(dT)纤维素的离心管中。
5. 混匀后室温放置5分钟，期间颠倒混匀数次。
6. 4℃ 200-1000g离心5分钟，小心将上清转移到一个离心管中。此上清液是去除了mRNA的总RNA。可以冰箱保存作为阴性对照。
7. 加入 0.5 mL 结合液，混匀后 4℃ 200-1000 g 离心 5 分钟，小心弃上清。
8. 重复上步 2-4 次。
9. 加入 50 μL RNA 洗脱液，混匀后 4℃ 200-1000 g 离心 5 分钟，小心收集上清（mRNA）。
10. 重复上步 1-3 次。
11. 将各次收集的 mRNA 混合，即为 mRNA 溶液。此溶液可以直接使用。如果太稀，可以按第三步方法浓缩。
第三步，用微量核酸沉淀剂沉淀 mRNA（详细操作见下）：
1. 按 2:1 的比例将本产品与第三步得到的 mRNA 溶液混合。注意：微量核酸沉淀剂有不溶的核酸助沉剂，所以用前需要摇匀以便所取的部分含有一定量的核酸助沉剂。
2. 室温 15000 g 离心 10 分钟(如果核酸含量在 2 ng 以下，建议离心 30 分钟)。
3. 弃上清后加 75%乙醇 1 mL，振荡混匀。
4. 15000 离心 3-5 分钟，弃上清。
5. 再短暂离心后小心吸弃上清，沉淀即为回收的 mRNA 沉淀，可溶于 DEPC水中直接使用或放-70℃长期保存。