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BTN81107 大提无内毒素质粒DNA提取试剂盒
发布时间：2017-10-01 08:15 | 点击次数：350
大提无内毒素质粒DNA提取试剂盒说明书
产品编号：BTN81107
规格：5T/10T
产品及特点：
本产品是整合大提质粒DNA提取试剂盒和菌体内毒素清除剂两产品而成。菌体内毒素清除剂是北京百奥莱博独家推出的产品，在质粒提取前就把细胞壁上的内毒素清除掉，彻底避免了目前通用的先提取DNA+内毒素混合物，再从中纯化质粒DNA 的弊端。用本产品提取的质粒DNA，内毒素的污染浓度低，适合于转染等对内毒素的污染敏感的实验。
1. 操作简单，只在经典的柱式质粒DNA 提取前，增加菌体内毒素清除一步。
2. 去内毒素效果好，处理一次可以去除99%以上的内毒素。
3. 质粒丢失少，产率只比柱式质粒DNA提取试剂盒低5-10%，效果好于先提质粒DNA，再用液相内毒素清除剂处理的方法。
4. DNA 可以直接用于转染等实验。
格及成分：
保存条件：
RNase A 溶液需4℃或-20℃保存，其余成分可室温保存，如有沉淀可加热溶解后再使用。
自备试剂：
50 mL收集管，TE缓冲液。
使用方法：
1. 用50 mL 塑料离心管收集不超过40 mL 的E.coli 饱和菌液，5,000 rpm离心5-10分钟，弃上清，得到细菌沉淀。
2. 加入10 mL 菌体内毒素清除剂，温和混匀后5,000 rpm 离心5-10分钟，弃上清（含内毒素）。
3. 重复上述操作3 次，得到的菌体将丢失了绝大部分细胞表面的内毒素。
4. 往细菌沉淀中加入5 mL 溶液A（第一次使用时需要将RNase A溶液全部加入并混合均匀，未用完的部分放4℃保存），充分振荡悬浮。注意：充分重悬细胞沉淀（无块状物）对于获得高的质粒产量十分重要。
5. 加5 mL 溶液B，温和翻转10 余次至透明。若混合液不透明，应减少细菌的用量或室温放臵5-10分钟直到裂解液变透明。注意: 避免剧烈振荡，否则细菌基因组DNA 将断裂为小片段，与质粒难以分离，污染质粒DNA。
6. 加入冰浴的7 mL 溶液C，颠倒混匀，冰上放臵10分钟。混合物中将有白色絮状物形成。注意不要过分振荡。
7. 在等待期间，活化离心吸附柱。在离心吸附柱中加入2.5mL 活化液，套上收集管后室温放臵2分钟，然后5,000 rpm 离心2分钟，倒弃穿透液，再将吸附柱套上收集管后待用。活化后的离心吸附柱必须立即使用。如果不活化，质粒得率将低20-40%左右。
8. 6000 rpm 离心10分钟。如果离心管承受能力强，离心速度还可以适当提高以充分沉淀絮状物。
9. 将上步得到的上清液移入到大提离心吸附柱中，放入50 mL收集管中。室温放臵5分钟左右以便让质粒DNA 跟膜结合。
10. 6000 rpm 离心5分钟，质粒DNA 将与大提离心吸附柱中的膜结合。弃穿透液。
11. 将10 mL通用洗柱液加入到离心吸附柱中，室温静臵2分钟后6000 rpm离心5分钟，弃穿透液。
12. 重复上步一次。
13. 室温6000 rpm 空甩5分钟，弃穿透液。注意：此步很重要，不能跳过，否则残留乙醇会影响后续实验。
14. 将大提离心吸附柱放入一个干净的50 mL 塑料离心管中，加0.5mL DNA洗脱液3.0（洗脱液如加热到50-65℃效果更佳），室温静臵2分钟后6000rpm 离心5分钟，收集液即是质粒DNA 溶液。
15. 重复上步3-4 次可洗脱更多的质粒DNA。DNA 洗脱液3.0 不够可以用TE或超纯水替代。
16. 合并所得质粒DNA，立即使用或-20℃储存。
注意事项：
1．细菌培养时间一般为12-16 小时，但接种量大时应减少时间。过度培养会降低质粒的质量甚至导致质粒DNA 突变。
2．注意溶液A：溶液B：溶液C 的比例为5：5：7。若细菌量增大，需按比例放大这些溶液的使用量。
3．随菌体增多应延长溶液B 的作用时间，直至溶液成粘稠透明状。但时间过长会导致质粒DNA 变性。
4．加溶液C 后形成的白色沉淀中有变性的蛋白质、细菌基因组DNA 和细胞碎片，离心后应避免带入到后续处理中。
5．通用洗柱液洗涤离心柱后必须甩干一次，否则残留通用洗柱液中的乙醇会干扰后续实验。
6．质粒的具体产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关。一般1.5 mL 过夜培养菌体可收获约10 μg 高拷贝质粒。
7．纯化的质粒在电泳中表现为2-3 条带有时甚至为4-6 条带均属正常，未分开的环套质粒，易被误判为基因组DNA。
产品编号：BTN81107
规格：5T/10T
产品及特点：
本产品是整合大提质粒DNA提取试剂盒和菌体内毒素清除剂两产品而成。菌体内毒素清除剂是北京百奥莱博独家推出的产品，在质粒提取前就把细胞壁上的内毒素清除掉，彻底避免了目前通用的先提取DNA+内毒素混合物，再从中纯化质粒DNA 的弊端。用本产品提取的质粒DNA，内毒素的污染浓度低，适合于转染等对内毒素的污染敏感的实验。
1. 操作简单，只在经典的柱式质粒DNA 提取前，增加菌体内毒素清除一步。
2. 去内毒素效果好，处理一次可以去除99%以上的内毒素。
3. 质粒丢失少，产率只比柱式质粒DNA提取试剂盒低5-10%，效果好于先提质粒DNA，再用液相内毒素清除剂处理的方法。
4. DNA 可以直接用于转染等实验。
格及成分：
| 成分 | 5T | 10T |
| 菌体内毒素清除剂 | 200ml | 200ml×2 |
| 溶液A | 25ml | 50ml |
| 溶液B | 25ml | 50ml |
| 溶液C | 35ml | 70ml |
| RNase A溶液(10mg/mL) | 300μl | 600μl |
| 吸附柱活化液 | 12.5ml | 25ml |
| 大提离心吸附柱 | 5套 | 10套 |
| 通用洗柱液 | 100ml | 200ml |
| DNA洗脱液3.0 | 10ml | 20ml |
| 说明书 | 1份 | 1份 |
RNase A 溶液需4℃或-20℃保存，其余成分可室温保存，如有沉淀可加热溶解后再使用。
自备试剂：
50 mL收集管，TE缓冲液。
使用方法：
1. 用50 mL 塑料离心管收集不超过40 mL 的E.coli 饱和菌液，5,000 rpm离心5-10分钟，弃上清，得到细菌沉淀。
2. 加入10 mL 菌体内毒素清除剂，温和混匀后5,000 rpm 离心5-10分钟，弃上清（含内毒素）。
3. 重复上述操作3 次，得到的菌体将丢失了绝大部分细胞表面的内毒素。
4. 往细菌沉淀中加入5 mL 溶液A（第一次使用时需要将RNase A溶液全部加入并混合均匀，未用完的部分放4℃保存），充分振荡悬浮。注意：充分重悬细胞沉淀（无块状物）对于获得高的质粒产量十分重要。
5. 加5 mL 溶液B，温和翻转10 余次至透明。若混合液不透明，应减少细菌的用量或室温放臵5-10分钟直到裂解液变透明。注意: 避免剧烈振荡，否则细菌基因组DNA 将断裂为小片段，与质粒难以分离，污染质粒DNA。
6. 加入冰浴的7 mL 溶液C，颠倒混匀，冰上放臵10分钟。混合物中将有白色絮状物形成。注意不要过分振荡。
7. 在等待期间，活化离心吸附柱。在离心吸附柱中加入2.5mL 活化液，套上收集管后室温放臵2分钟，然后5,000 rpm 离心2分钟，倒弃穿透液，再将吸附柱套上收集管后待用。活化后的离心吸附柱必须立即使用。如果不活化，质粒得率将低20-40%左右。
8. 6000 rpm 离心10分钟。如果离心管承受能力强，离心速度还可以适当提高以充分沉淀絮状物。
9. 将上步得到的上清液移入到大提离心吸附柱中，放入50 mL收集管中。室温放臵5分钟左右以便让质粒DNA 跟膜结合。
10. 6000 rpm 离心5分钟，质粒DNA 将与大提离心吸附柱中的膜结合。弃穿透液。
11. 将10 mL通用洗柱液加入到离心吸附柱中，室温静臵2分钟后6000 rpm离心5分钟，弃穿透液。
12. 重复上步一次。
13. 室温6000 rpm 空甩5分钟，弃穿透液。注意：此步很重要，不能跳过，否则残留乙醇会影响后续实验。
14. 将大提离心吸附柱放入一个干净的50 mL 塑料离心管中，加0.5mL DNA洗脱液3.0（洗脱液如加热到50-65℃效果更佳），室温静臵2分钟后6000rpm 离心5分钟，收集液即是质粒DNA 溶液。
15. 重复上步3-4 次可洗脱更多的质粒DNA。DNA 洗脱液3.0 不够可以用TE或超纯水替代。
16. 合并所得质粒DNA，立即使用或-20℃储存。
注意事项：
1．细菌培养时间一般为12-16 小时，但接种量大时应减少时间。过度培养会降低质粒的质量甚至导致质粒DNA 突变。
2．注意溶液A：溶液B：溶液C 的比例为5：5：7。若细菌量增大，需按比例放大这些溶液的使用量。
3．随菌体增多应延长溶液B 的作用时间，直至溶液成粘稠透明状。但时间过长会导致质粒DNA 变性。
4．加溶液C 后形成的白色沉淀中有变性的蛋白质、细菌基因组DNA 和细胞碎片，离心后应避免带入到后续处理中。
5．通用洗柱液洗涤离心柱后必须甩干一次，否则残留通用洗柱液中的乙醇会干扰后续实验。
6．质粒的具体产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关。一般1.5 mL 过夜培养菌体可收获约10 μg 高拷贝质粒。
7．纯化的质粒在电泳中表现为2-3 条带有时甚至为4-6 条带均属正常，未分开的环套质粒，易被误判为基因组DNA。