BTN81109 酵母化学感受态细胞制备试剂盒

酵母化学感受态细胞制备试剂盒说明书
产品编号：BTN81109
规格：20T（A）/20T（B）
产品及特点：
本酵母化学感受态细胞制备试剂是一种通过化学处理，高效快速制备酿酒酵母化学感受态细胞，用于长期冻存以备后续转化的产品，它具有下列特点：
1. 一次制备，-80℃保存，多次使用，免去每次转化都要制备酿酒酵母感受态细胞。
2. 操作简单，单溶液制备，除酵母培养的时间外，整个操作只需要30 分钟
3. 主要用于酿酒酵母S. cerevisiae，也适用于其他多种实验用酵母菌株，包括S. pombe、C. albicans、Pichia pastoris 等。
4. 受体酵母可以不含质粒，也可用于携带有选择性质粒的酵母。
5. 对酿酒酵母，最高转化效率可达到0.2-1×10⁵ 个转化子/μg 质粒DNA。对其他酵母，效率稍低，范围在100-2000个转化子/μg质粒DNA。
6. 得到的感受态细胞可以用各种线性或环状酵母穿梭质粒DNA 进行转化，例如YIp, YRp, YCp, YEp 和YAC 等。
7. 可以用于酵母双杂交、定点突变（Site－Directed Mutagenesis）、基因破坏（Gene Disruption）、等位突变基因修复（Mutant Allele Recovery）等实验。
8. 本产品可以制备20 只酵母感受态细胞（需要200mL 酵母培养液），其中A型只用于制备感受态细胞，B 型还带高效转化液。
规格及成分：

成分	20T（A）	20T（B）
制备液A	120ml	120ml
制备液B	6ml	6ml
制备液C	10ml	10ml
转化液A	无	30ml
转化液B	无	30ml
说明书	1份	1份

保存条件：
常温运输和保存，有效期一年。
自备试剂：
YPD 培养基
使用方法：
一：酵母化学感受态细胞的制备
说明：按本方法制备1 管酵母化学感受态细胞就需要OD600 达到0.6-1.0 的新鲜酵母培养液10 mL，用户需根据所需酵母感受态细胞的数量决定培养细胞的体积。如果超过10 mL，则制备液的使用量需要按比例增加。
1. 挑取酵母受体菌的新鲜的单菌落（4℃放置不超过3 周的也可以），接种到装在50mL 离心管中的10 mL 的自备的YPD 培养基中。
2. 30℃摇晃培养，摇床速度250 rpm/分钟，直到OD600 达到0.6-1.0（相当于0.6-1×10⁷ 细胞/mL）。
3. 室温3000rpm 离心5 min，弃上清得酵母细胞沉淀。
4. 新鲜制备适量的酵母感受态制备工作液。对10 mL 酵母需要5.25 mL的工作液，其配制方法是：将4.75 mL 制备液A、0.25 mL 制备液B和0.25 mL 制备液C 加入到一个无菌的离心管中后充分震荡混匀即可。
酵母感受态制备工作液可放室温待用。
5. 用0.5 倍体积的新鲜配制的酵母感受态制备工作液洗涤酵母细胞沉淀一次（对10 mL 酵母则需要5 mL 酵母感受态制备工作液）。即混合后振荡1 分钟，室温3000rpm 离心3 分钟，去上清得洗涤后的酵母细胞沉淀。
6. 再用0.02 倍体积的酵母感受态制备工作液充分重悬菌体（对10 mL酵母，则需要0.2 mL 酵母感受态制备工作液）。
7. 按每管0.2 mL 分装到冷冻管中，放入保温冰盒中冷却半小时后再放入-80℃冰箱待用。0.2 mL 的感受态细胞足够1 次转化使用。注意：放入保温冰盒的目的是使温度缓慢下降，急冻将使转化效率降低，这点跟大肠杆菌感受态制备过程不同。
二：化学转化酵母感受态细胞（只有B 型提供相关试剂）
1. 将总体积不超过20 μL 的0.1-5 μg 质粒DNA 加到刚从-80℃冰箱取出的、还处于凝固状态的0.2 mL 酵母感受态细胞上。注意：最好同时做一个不加质粒DNA 的阴性对照组。
2. 室温充分振荡直到凝固的感受态细胞完全融化。注意：此步非常关键，如果能在恒温振荡器上37℃振荡5 分钟，则效果更好。
3. 加入1.4mL 转化液A，轻柔颠倒混匀一分钟。
4. 30℃培养1 小时。
5. 室温3000g 离心5 秒，弃上清。
6. 在酵母细胞沉淀中加1.0 mL 转化液B，振荡一分钟。
7. 室温3000g 离心5 秒，弃上清。
8. 在酵母沉淀细胞中加入适量（如100 μL）的转化液B，混匀后在在选择培养基上全部涂盘。
9. 30℃培养3-5 天后即得酵母转化菌落。