BTN90317 一站式DNA尿素-PAGE电泳套装

一站式DNA尿素-PAGE电泳套装说明书
产品编号：BTN90317
规格：30T
产品及特点：
本产品是专门用于DNA 尿素-PAGE 电泳的一站式试剂盒，它具有下列特点:
1. 一站式，即开即用，用户不需单独准备各种成分，十分方便。用户不需要单独准备各种成分。
2. 可用于DNA 测序、AFLP、DDRT、TGGE 和RNase 保护实验等。
3. 安全，免去了实验人员接触粉末状的剧毒物品丙烯酰胺。
4. 电泳后可直接用于银染、EB 染色等实验。
规格及成分：

成分	规格
电泳级尿素	210g
电泳级丙烯酰胺	77.34g
电泳级甲叉双丙烯酰胺	2.67g
10×TBE电泳液	250ml
电泳级TEMED	1.5ml
电泳级过硫酸铵	1g
2×尿素-PAGE 上样液	1ml
说明书	1份

保存条件：
常温运输，保存条件见上表，有效期一年。
自备试剂：
去离子水。
使用方法：
一、PAGE 浓度和交联度的选择指南
尿素-PAGE 一般推荐用29：1（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺）的交联度，
在此条件下，DNA 片段和最适PAGE 浓度对应关系如下：

单链DNA长度	最佳PAGE 浓度	二甲苯青FF迁移率对应的长度	溴酚蓝的迁移率应的长度
50-400nt	8%	160nt	45nt
200-1000nt	5%	260nt	65nt
750-2000nt	3.5%	460nt	100nt

二、制备尿素-PAGE 胶
1. 配制尿素-PAGE 胶（这是配制100 mL 胶的用量，配制更大体积的胶则需以此用量为基础按比例增加）
A：新鲜配制10%的APS（过硫酸铵）：按每0.1 克过硫酸铵干粉加1mL超纯水的比例将水加到装有硫酸铵干粉的1.5 mL EP 管中，摇晃到粉末全部溶解。配制好的10%的APS 溶液可以在4℃存放一周。
B：新鲜交联度为29：1 的40%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液（AB溶液，下同）：在装有77.34 g 电泳级丙烯酰胺干粉的瓶中加入约120mL 自备的去离子水，然后将全部甲叉双丙烯酰胺加入到同一塑料瓶中（可以加少量丙烯酰胺溶液冲洗出来以避免粉末有毒粉末飘出。甲叉双丙烯酰胺溶解度低，不会溶解在这少量溶液中）。充分摇晃混匀后
所得溶液即40%的AB 溶液。配制40%而非30%的原因是这样可以在下步留出足够空间加尿素。
B：配尿素-PAGE 胶：在一个250 mL 的三角瓶中，先按下表的用量加入去离子水、40%AB 溶液和10×TBE 缓冲液。丙烯酰胺单体溶液具有神经毒性，一定要戴手套操作。

PAGE胶浓度	各成分用量（尿素为克，其余单位是mL）			补水到（mL）
	尿素	40%AB溶液	10×TBE缓冲液
5%	42	12.5	5.0	100
6%	42	15.0	5.0	100
7%	42	17.5	5.0	100
8%	42	20.0	5.0	100
9%	42	22.5	5.0	100
10%	42	25.0	5.0	100
11%	42	27.5	5.0	100
12%	42	30.0	5.0	100

C：搅拌溶解，然后用滤纸过滤。最好能抽真空10-15分钟以去除溶液中
的氧气（氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应），无条件也可以不脱氧。
D：加入500μL 10%APS 和100μL TEMED，迅速摇匀后倒胶。
E: 在胶的液面距离达到顶部时停止灌胶，插入梳子。
F: 室温聚合30-60分钟（低温抑制聚合反应）。
G: 拔出梳子，用0.5×TEB 液冲洗加样孔。
三、样品准备
2. 对一般样品、测序样品、微卫星DNA、AFLP 样品、DDRT 样品、RPA
样品：将样品跟上样液1:1 混合，95℃ 3分钟变性，然后放冰上待用。
3. 对 TGGE 样品：可以直接上样。
四：电泳
4. 将凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入足够0.5×TEB 电泳液。
5. 预电泳5-30分钟将冰上放置的样品上样。
6. 连接电源线，打开电源开关。根据胶的大小选择功率（固定功率可以固定产热，这样不容易发生过热而使胶板破裂的现象。如果固定电流或电压，产热都将随电泳时间而变化，不好控制）。
对小胶一般用5-6W 固定功率，大胶用15-25W 固定功率。
7. 终止电泳，取出凝胶进行后续的处理（如银染）。注意：如果银染，必须延长固定时间以便让洗出尿素，否则残留尿素会干扰后面的银染。