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BTN90502 AMV逆转录酶
发布时间：2017-10-01 09:57 | 点击次数：454
AMV逆转录酶说明书
产品编号：BTN90502
规格：200U
产品及特点：
AMV 逆转录酶分离自禽类成髓细胞瘤病毒（AMV），其方法由 Houts等人的方法改进而来。分离得到的酶是分子量为157KD 的 αβ 全酶。本酶经高度纯化，完全无核酸酶污染。本酶可用于cDNA 合成，也可用于RNA 和DNA 的双脱氧测序。AMV 逆转录酶以总RNA 或polyA+ RNA 为模板，具有以RNA为模板的DNA聚合酶活性，DNA 为模板的DNA聚合酶活性和RNase H酶活性，最适反应温度在42-55℃，最高可达60℃，如果使用焦磷酸钠，最适温度为37-41℃。按照标准使用方法可以得到长至10-12 kb cDNA。
AMV 逆转录酶比普通AMV 逆转录酶和MMLV 逆转录酶能耐受更高的温度和合成更长的cDNA。它具有下列特点：
1. 高灵敏度,可以1ng 的总RNA 进行cDNA 合成。
2. 反应温度可升高到60℃，可有效打开RNA 二级结构，适用于二级结构复杂的RNA 模板。
3. 可合成长至 10-12kb 的cDNA。
4. 可用于first strand cDNA 合成、RT-PCR、RNA 测序和双脱氧法DNA测序、引物延伸和DNA 片段的3’-末端标记。
5. 本酶具有内源性的RNase H 活性，所以最好不要用于cDNA 文库的构建。
规格及成分：
保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
使用方法：
一：合成1st-strand cDNA
1. 按下表配制RT 反应体系:
注意：RNA 样品不能有基因组DNA污染。
引物
注意：随机引物于RNA 模板的比例跟最后得到的cDNA 的平均长度成反比。
RNase-free 水 补水到11 μL
2. 70℃保温5 分钟后立即冰浴。
3. 严格按下表顺序加入各成分：
4. 补水使反应终体积为25μL。
5. 42℃保温60 分钟（对Oligo dT 引物或模板专一引物）或37℃保温60 分钟（对随机引物）。如果不使用焦磷酸钠，反应温度可以提高到42-55℃，最高可达60℃。
6. 70℃保温10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的cDNA 可以直接作为PCR 模板使用，不需要纯化。50μL Taq DNA 聚合酶催化的PCR 体系中最多可以使用25μL 的RT 产物，一般使用10 μLAMV 催化的RT 产物即可。
二、RNA 测序：参考下面文献
Mierendorf,R.C. and Pfeffer,D. (1987) Sequencing of RNA transcripts synthesized in vitro from plasmids containing bacteriophage promoters. Meth. Enzymo.152,563-566
相关资料：
AMV Buffer 成份：
储存Buffer：200 mM potassium phosphate （pH 7.2 at 4℃），2mM DTT，0.2% (v/v) Triton X-100 和 50% (v/v) glycerol。
反应Buffer，5×：
250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)，250 mM KCl，50 mM MgCl2，2.5mM spermidine and 50 mM DTT。
注意：此buffer 不能与MMLV 的buffer 互换。同时此buffer 不含dNTP，在用于cDNA 合成时需要自己添加。
活性定义：
以poly(rA)为模板，以oligo(dT)12-18 为引物，在37℃温度下，在10 分钟将1 nmol 的 dTMP 掺入到多核苷酸中所需酶量为一个单位。
酶反应条件为:
50 mM Tris-HCl (pH 8.3)，8.75 mM MgCl2，10 mM DTT，40 mM KCl，1 mM 同位素标记的dTTP ， 0.1mg/mL acetylasted BSA,0.25mM polyA•oligo(dT)12-18。
产品编号：BTN90502
规格：200U
产品及特点：
AMV 逆转录酶分离自禽类成髓细胞瘤病毒（AMV），其方法由 Houts等人的方法改进而来。分离得到的酶是分子量为157KD 的 αβ 全酶。本酶经高度纯化，完全无核酸酶污染。本酶可用于cDNA 合成，也可用于RNA 和DNA 的双脱氧测序。AMV 逆转录酶以总RNA 或polyA+ RNA 为模板，具有以RNA为模板的DNA聚合酶活性，DNA 为模板的DNA聚合酶活性和RNase H酶活性，最适反应温度在42-55℃，最高可达60℃，如果使用焦磷酸钠，最适温度为37-41℃。按照标准使用方法可以得到长至10-12 kb cDNA。
AMV 逆转录酶比普通AMV 逆转录酶和MMLV 逆转录酶能耐受更高的温度和合成更长的cDNA。它具有下列特点：
1. 高灵敏度,可以1ng 的总RNA 进行cDNA 合成。
2. 反应温度可升高到60℃，可有效打开RNA 二级结构，适用于二级结构复杂的RNA 模板。
3. 可合成长至 10-12kb 的cDNA。
4. 可用于first strand cDNA 合成、RT-PCR、RNA 测序和双脱氧法DNA测序、引物延伸和DNA 片段的3’-末端标记。
5. 本酶具有内源性的RNase H 活性，所以最好不要用于cDNA 文库的构建。
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| AMV 逆转录酶 (10 U/μL) | 20μl |
| 5×AMV Buffer | 200μl |
| 说明书 | 1份 |
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
使用方法：
一：合成1st-strand cDNA
1. 按下表配制RT 反应体系:
| RNA | 模板 |
| 总RNA | 500-2000 ng |
| 或poly(A) mRNA | 50-500 ng |
| 或专一的RNA | 0.05pg-500ng |
引物
| Oligo (dT)18(0.5ug/μL) | 1 μL |
| 或随机引物(0.2ug/μL) | 1 μL |
| 或RNA 模板专一性引物 | 15-20pmol |
RNase-free 水 补水到11 μL
2. 70℃保温5 分钟后立即冰浴。
3. 严格按下表顺序加入各成分：
| 5×AMV Buffer （本产品提供） | 5 μL |
| RNase Inhibitor (40U/μL,自备) | 1 μL |
| 焦磷酸钠 40mM（预热到42℃） | 2.5 μL |
| dNTP (10 mM each,自备) | 2.5 μL |
| AMV 逆转录酶 | 1-3 μL(=10-30 U) |
5. 42℃保温60 分钟（对Oligo dT 引物或模板专一引物）或37℃保温60 分钟（对随机引物）。如果不使用焦磷酸钠，反应温度可以提高到42-55℃，最高可达60℃。
6. 70℃保温10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的cDNA 可以直接作为PCR 模板使用，不需要纯化。50μL Taq DNA 聚合酶催化的PCR 体系中最多可以使用25μL 的RT 产物，一般使用10 μLAMV 催化的RT 产物即可。
二、RNA 测序：参考下面文献
Mierendorf,R.C. and Pfeffer,D. (1987) Sequencing of RNA transcripts synthesized in vitro from plasmids containing bacteriophage promoters. Meth. Enzymo.152,563-566
相关资料：
AMV Buffer 成份：
储存Buffer：200 mM potassium phosphate （pH 7.2 at 4℃），2mM DTT，0.2% (v/v) Triton X-100 和 50% (v/v) glycerol。
反应Buffer，5×：
250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)，250 mM KCl，50 mM MgCl2，2.5mM spermidine and 50 mM DTT。
注意：此buffer 不能与MMLV 的buffer 互换。同时此buffer 不含dNTP，在用于cDNA 合成时需要自己添加。
活性定义：
以poly(rA)为模板，以oligo(dT)12-18 为引物，在37℃温度下，在10 分钟将1 nmol 的 dTMP 掺入到多核苷酸中所需酶量为一个单位。
酶反应条件为:
50 mM Tris-HCl (pH 8.3)，8.75 mM MgCl2，10 mM DTT，40 mM KCl，1 mM 同位素标记的dTTP ， 0.1mg/mL acetylasted BSA,0.25mM polyA•oligo(dT)12-18。