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BTN90603 随机引物法DNA探针标记试剂盒
发布时间：2017-10-01 10:04 | 点击次数：199
随机引物法DNA探针标记试剂盒说明书
产品编号：BTN90603
规格：5T(A)
产品及特点：
本产品是基于Feinberg和Vogelstein发明的随机引物标记法而开发出来的即用型DNA探针标记试剂盒，标记过程由双链DNA热变性、随机引物与单链DNA结合、在Klenow DNA聚合酶催化下，引物的延伸合成DNA探针并掺入标记的核苷酸三步组成，可用下面的示意图表示：
本产品对Feinberg和Vogelstein经典方法进行了改良，具有下列特点：
1. 提供的标记反应液整合了除酶和模板外的所有成分，简化了反应加样步骤，提高了标记反应的可重复性。
2. 使用无外切活性的Klenow exo- DNA聚合酶，已标记DNA探针不会被酶降解。
3. 快速，最快1小时即可完成标记反应。
4. 得到的DNA探针比活性高（如果是同位素，可以达到109cpm/μg DNA），检测灵敏度高。
5. 所需模版DNA量少（只需要10ng以上即可），DNA可以是各种形状（线状和环状）的、也可以是单链或双链的，长度在100 bp以上均可。
6. 得到的探针长度在200-400 nt之间，可以用于Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等。
7. 提供三种标记选择，其中90603A可用于各种同位素标记和其他任何非同位素标记，但需自备标记底物；90603B和90603C可分别用于生物素和地gao辛标记，不需自备标记底物。
规格及成分：
保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
0.5M EDTA（pH8.0）。如果是A型，则需要自备标记的核苷酸。
使用方法：
注意：非同位素标记物由于疏水性强，容易与常用的塑料离心管表面非特异性结合，所以一定要使用硅化的塑料离心管。模板DNA并非越多越好，因为模板会在杂交反应中跟标记的探针杂交，竞争性地抑制探针跟靶分子的杂交。
2. 沸水浴5-10分钟，或在PCR仪上100℃加热5-10分钟使DNA模版充分变性，立即放冰上待用。注意：如果PCR仪器不能设置到100℃，99℃加热5分钟也可。
3. 高速离心数秒使所有液体集中在管底，根据试剂盒类型加入下列成份：
注：上表中的dTTP/标记dUTP混合物中dTTP和标记的dUTP的总浓度为2mM（在20μL体系中混合液的终浓度为0.1mM，dTTP与生物素或DIG标记的dUTP的比例最好为65：35）。由于空间阻碍，并非标记生物素或DIG标记的dUTP越多灵敏度越高，一般dTTP与标记dUTP的比例在65：35为最佳。但如果使用自备的其他标记核苷酸，如fluorescein、hydroxycoumarin、resorufin和aminoallyl标记的dUTP，则用户需要自己摸索其与dTTP之间的最佳比例，如果使用32P标记的dUTP，则比活最好为3000Ci/mmol，浓度为好为10uCi/μL，并且不需要加入dTTP。
4. 轻柔吹打混匀。如有液滴沾在管壁上，高速离心数秒使所有液体集中在管底。
5. 37℃保温1-20小时。标记效率跟模版量和保温时间相关，具体见下表：
6. 加1 μL自备的0.5M EDTA（pH 8.0）终止反应，立即放冰上待用或放-20℃保存一年。用前需要加热100℃ 5分钟使DNA探针变性成单链，然后直接加入到杂交反应液中即可。如果电泳检测，标记产物将是弥散状态。
注意：本方法标记核苷酸掺入率极高，因此可以不经纯化直接使用。如果需要纯化，注意不要用酚抽提法纯化非同位素（生物素、DIG和其他等）标记的DNA探针，因为这些标记分子疏水性强，能使标记的DNA进入疏水的有机相而丢失，但可以用乙醇沉淀和Sephadex G50回收（可另购非同位素探针柱式纯化试剂盒）。对比活高的同位素探针，由于其极其不稳定，因此应该立即使用，不要长久放置。
产品编号：BTN90603
规格：5T(A)
产品及特点：
本产品是基于Feinberg和Vogelstein发明的随机引物标记法而开发出来的即用型DNA探针标记试剂盒，标记过程由双链DNA热变性、随机引物与单链DNA结合、在Klenow DNA聚合酶催化下，引物的延伸合成DNA探针并掺入标记的核苷酸三步组成，可用下面的示意图表示：
本产品对Feinberg和Vogelstein经典方法进行了改良，具有下列特点：
1. 提供的标记反应液整合了除酶和模板外的所有成分，简化了反应加样步骤，提高了标记反应的可重复性。
2. 使用无外切活性的Klenow exo- DNA聚合酶，已标记DNA探针不会被酶降解。
3. 快速，最快1小时即可完成标记反应。
4. 得到的DNA探针比活性高（如果是同位素，可以达到109cpm/μg DNA），检测灵敏度高。
5. 所需模版DNA量少（只需要10ng以上即可），DNA可以是各种形状（线状和环状）的、也可以是单链或双链的，长度在100 bp以上均可。
6. 得到的探针长度在200-400 nt之间，可以用于Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等。
7. 提供三种标记选择，其中90603A可用于各种同位素标记和其他任何非同位素标记，但需自备标记底物；90603B和90603C可分别用于生物素和地gao辛标记，不需自备标记底物。
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| 2×A型标记反应液（自备标记物型） | 50μl(仅A型有) |
| 2×B型标记反应液（生物素型） | 50μl(仅B型有) |
| 2×C型标记反应液（DIG型） | 50μl(仅C型有) |
| dATP，2 mM | 10μL（仅A型有） |
| dTTP，2 mM | 10μL（仅A型有） |
| dGTP，2 mM | 10μL（仅A型有） |
| dCTP，2 mM | 10μL（仅A型有） |
| Klenow exo-聚合酶（2U/μL） | 5μl |
| 超纯水 | 1ml |
| 说明书 | 1份 |
保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
0.5M EDTA（pH8.0）。如果是A型，则需要自备标记的核苷酸。
使用方法：
- 在一干净的硅化的塑料离心管中加入下列成分：
| 成分 | 用量 |
| 模板DNA | 50-150ng |
| 2×标记反应液(ABC三种之一) | 10μl |
| 超纯水 | 补水到15μl |
2. 沸水浴5-10分钟，或在PCR仪上100℃加热5-10分钟使DNA模版充分变性，立即放冰上待用。注意：如果PCR仪器不能设置到100℃，99℃加热5分钟也可。
3. 高速离心数秒使所有液体集中在管底，根据试剂盒类型加入下列成份：
| 试剂盒类型 | 成分及用量 |
| A型 | dATP、dGTP、dCTP各1 μL（共3μL，浓度均为2mM） 自备的2mM dTTP/标记dUTP混合物（见注）1μL 1 μL Klenow exo聚合酶 |
| B型 | 1 μL Klenow exo聚合酶 4 μL超纯水 |
| C型 | 1 μL Klenow exo聚合酶 4 μL超纯水 |
4. 轻柔吹打混匀。如有液滴沾在管壁上，高速离心数秒使所有液体集中在管底。
5. 37℃保温1-20小时。标记效率跟模版量和保温时间相关，具体见下表：
| 模版DNA用量（ng） | 1小时后探针合成量（ng） | 20小时后探针合成量（ng） |
| 10 | 80 | 900 |
| 30 | 150 | 1350 |
| 100 | 350 | 1650 |
| 300 | 750 | 2200 |
| 1000 | 1300 | 2600 |
| 3000 | 1600 | 2600 |
注意：本方法标记核苷酸掺入率极高，因此可以不经纯化直接使用。如果需要纯化，注意不要用酚抽提法纯化非同位素（生物素、DIG和其他等）标记的DNA探针，因为这些标记分子疏水性强，能使标记的DNA进入疏水的有机相而丢失，但可以用乙醇沉淀和Sephadex G50回收（可另购非同位素探针柱式纯化试剂盒）。对比活高的同位素探针，由于其极其不稳定，因此应该立即使用，不要长久放置。