BTN90607 柱式BAC DNA提取试剂盒

柱式BAC DNA提取试剂盒说明书
产品编号：BTN90607
规格：50T
产品及特点：
BAC 是专门用于克隆长片段插入片段的载体，可以插入的片段一般在30-300 Kb，平均长度为130 Kb。但用常规的质粒DNA 提取方法提取15 Kb以上的质粒DNA 效果都不尽人意，为此本公司对常规的方法进行了诸多改良，它具有下列特点：
1. 使用于不超过 100 kb 的大型质粒DNA，包括BAC、PAC、P1 和Cosmid等。如果超过100 kb，建议使用沉淀法或离子交换法。
2. 每 mL 细菌培养液可纯化到50-150 ng 左右的BAC 和其他大型质粒DNA。
3. 安全，无酚氯仿等危险的有机物抽提。
4. 柱式操作，比经典的沉淀法操作简单，重复性好，每次都能获得理想效果。
5. 得到的 DNA 纯净，可以直接用于PCR、酶切和测序，不需要再纯化。
6. 超值，性价比高。
规格及成分：

成分	规格
溶液A	13ml
溶液B	13ml
溶液C	18ml
RNase A溶液(10mg/mL)	0.75ml
离心吸附柱	50套
通用洗柱液	50ml
DNA洗脱液	10ml
说明书	1份

保存条件：
常温运输及保存（RNase A 溶液需要4℃保存），有效期一年。
使用方法：
1. 接种单个菌落到 2-5mL LB 培养基中，37℃摇晃过夜培养。注意：不要使用Terrific Broth 或2×YT 培养基等高营养培养基，因为这样得到的菌液细菌密度太高，纯化BAC 时，蛋白质和RNA 污染较多，反而会影响BAC 的产率。
2. 12000-15000×g 4℃离心5分钟，弃上清（培养基），再短暂离心，吸弃残留液体（培养基），得到细菌沉淀。
3. 用 250μL溶液A（第一次用前需先将全部RNase A溶液加入到13 mL溶液A中，摇匀后再取用。未用完的溶液A最好在4℃保存)重悬细胞沉淀，必要时用枪头充分吹打使菌体重悬已保证没有成团的细菌块。
4. 冰上放置5分钟。
5. 加入 250μL溶液B（如果溶液B 有沉淀，用前须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用），温和反复颠倒混匀4-6次，看到溶液变粘即可。此步处理不能超过5 分钟，否则DNA 的碱损伤比较严重。千万不要剧烈振荡，否则基因组DNA 断裂产生的片段非常容易污染BAC DNA。
6. 冰上放置4分钟。注意：一定要严格控制时间，时间超过4 分钟，BAC产率将大大降低。
7. 加入 350μL溶液C，轻柔颠倒混匀4-6次，可见白色沉淀物产生。
8. 冰上放置5 分钟。
9. 室温 12000-15000 g 离心10 分钟，小心将上清液转移到离心吸附柱中。
由于此时的溶液比重较大，有时候出现沉淀漂浮是正常现象，取上清时避开漂浮的沉淀即可。
10. 静置 2 分钟以让BAC DNA 与吸附柱充分结合，此步十分重要。
11. 室温 12000-15000g离心1分钟，弃收集管中的废液。
12. 加入 500μL的通用洗柱液，室温12000-15000g离心1 分钟，弃收集管中废液。注意：通用洗柱液中含乙醇，用后需要将盖拧紧存放，否则乙醇会挥发。
13. 重复上步1 次。
14. 室温 12000-15000 g 离心1 分钟，甩干残留液体。此步不能省略，否则残留乙醇会影响DNA 的后续使用（如DNA 上样时不能沉淀到加样孔中）。
15. 将离心吸附柱置于一个新的1.5 mL塑料离心管（自备）中，加入30-50μL 65-80℃预热的DNA 洗脱液，室温放置2 分钟。常温的DNA 洗脱液也可以用于洗脱，但产量稍微有所降低。
16. 室温 12000-15000g离心1 分钟，离心管底溶液即BAC DNA。
17. 由于百奥莱博的吸附柱结合DNA 能力较强，如果再加适量DNA洗脱液到离心吸附柱中，往往还能洗脱下很多BAC DNA（相当于第一次洗脱的20-30%），但注意不要使用上步得到的DNA 洗脱液来洗脱。
18. 得到的BAC DNA即可用于后续的检测或实验。
其他处理：
1. 如果要制备无内毒素BAC DNA，则需要用液相内毒素清除剂（需要另购）处理BAC DNA溶液。或者在提取BAC DNA之前，用菌体内毒素清除剂（需要另购）处理细菌。
2. 如果有基因组 DNA 污染，可以用线状DNA 清除剂（需要另购）将其酶解。
3. 如果有 RNA污染，可以加入RNase 酶解，然后用酚氯仿抽提，再用乙醇沉淀。
4. 如果有蛋白质污染，可以用酚氯仿抽提，再用乙醇沉淀。