BTN90613 动物细胞核蛋白微量制备试剂盒

动物细胞核蛋白微量制备试剂盒说明书
产品编号：BTN90613
规格：25T/100T
产品及特点：
DNA 只存在于细胞核内，因此参与转录调节和DNA 复制的蛋白质主要存在于细胞核中，要研究蛋白质与DNA 的相互作用，首先需要制备能够与DNA 作用的天然细胞核蛋白质。目前、细胞核蛋白质制备方法一般都比较繁琐，一次处理大量样品时尤其不便，为此本公司开发了本产品，用于从哺乳动物组织和培养细胞核蛋白的微量提取，它具有下列特点：
1. 提取制备过程简便，只需要一小时。
2. 实验重复性好，尤其适合同时处理多个样品。
3. 可用于培养的动物细胞，也可以用于新鲜组织细胞。
4. 制备的核蛋白能保持天然活性，可以直接用于转录因子活性分析、凝胶阻滞实验(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting、DNA 足迹图实验和甲基化干扰实验酶活性测定等研究。
规格及成分：

成分	25T	100T
溶液A	10ml	40ml
溶液B	2.5ml	10ml
说明书	1份	1份

保存条件：
低温运输、4℃保存，有效期一年。
自备试剂：
PMSF、DTT、PBS等。
使用方法：
实验前准备：取适当量的溶液A 和溶液B 置于冰上，在使用前数分钟内分别向溶液A和溶液B中加入自备的PMSF 和DTT，使PMSF 的最终浓度为0.2 mM，DTT的最终浓度为1mM。实验中所用试剂均需先预冷。
一、对培养细胞和悬浮细胞：
1. 对培养细胞：将覆盖率为55-65%的培养细胞用自备的胰酶溶液（BTN90306）按标准的胰酶法处理，然后刮到1.5 mL 塑料离心管中，4℃ 800g离心30秒，小心弃上清。
2. 对悬浮细胞：直接将5×105-7 个的悬浮细胞转移到1.5 mL 塑料离心管中，4℃800g 离心30秒，小心弃上清。
3. 用 1.5 mL 自备的预冷的PBS 缓冲液洗涤细胞沉淀一次，然后4℃离心后弃上清。
4. 在细胞沉淀中加入400 μL 预加了PMSF和DTT的溶液A，用手指弹管壁使沉淀悬浮起来。
5. 冰浴 10分钟，涡旋激烈震荡10秒混匀。
6. 4℃ 2500g 离心10秒，小心弃上清。
7. 在沉淀中加入100 μL 预加了PMSF 和DTT 的溶液B，轻轻混匀使沉淀悬浮起来。
8. 冰浴 20分钟。
9. 4℃ 12,000-16,000g 离心10分钟，小心收集上清液（细胞核提取物），可立即用于后续的凝胶滞后实验、BCA 法蛋白浓度测定或活性检测等实验，也可以分装后放-70℃长期保存。
说明：本方法可以从1×106 的细胞中得到50-70 ug 的核蛋白质。
二、对新鲜组织：
10. 将 100-150 mg 新鲜组织置于培养皿中，用手术剪将组织尽可能切成非常细小的碎片，尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，用自备的预冷的PBS洗涤2次，离心后去上清。在组织沉淀中加入400 μL 预加了PMSF 和DTT的溶液A，冰浴或4ºC 下在Dounce 或Potter 玻璃匀浆器（BTN101103 ，可向本公司订购）内充分匀浆，一般上下手动匀浆30-50次（匀浆后应镜检，细胞破碎率不小于90%，同时没有明显的组织小块）。
11. 匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，用手指弹管壁使沉淀悬浮起来，冰浴放置10-20分钟，涡旋激烈震荡10秒混匀。
12. 接下来按照步骤6-9操作，即得到新鲜组织细胞核蛋白提取物。
注意事项：
1. 所有接触样品的用具和试剂均需预冷，以免蛋白质的降解及失活。
2. PMSF 一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF 在水溶液中很快失效。
3. 本试剂盒只适用于新鲜的组织样品，对冻存过的组织抽提效果不是很理想。