BTN90708 即用型高保真PCR试剂盒

即用型高保真PCR试剂盒说明书
产品编号：BTN90708
规格：1.5mL/9mL
产品及特点：
本产品是即用型的2×高保真PCR 预配反应液，含有除引物、模板以外的所有PCR 试剂，包括Pfu DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR 增强剂、上样染料等，特别适合于高保真PCR 反应。
1. Pfu DNA 聚合酶是使用最广泛的高保真酶，其保真度为普通Taq 酶的10 倍。
2. 使用时只需在加入模板和引物并稀释到1 倍浓度即可进行PCR 反应，非常方便，简化了PCR 的准备工作。
3. PCR 反应所必需试剂全集于一管之中，数分钟即可完成反应体系配置。由于加样过程少，有利于减少污染，降低实验误差。
4. 本产品A 型含电泳染料，PCR 反应液可直接上样电泳，进一步简化了操作。
5. 由于各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。
6. 适用于基因的高保真扩增和基因定点突变等实验，得到的PCR 产物可用于平末端克隆。
规格及成分：

成分	A型	B型
2×高保真PCR MagicMix	1.5mL/9mL	1.5mL/9mL
专用染料	无	60μl/360μl
说明书	1份	1份

保存条件：
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。
自备试剂：
模板和引物。
使用方法：
将本产品与用户自备的模板，引物混合液按下列推荐使用量（30 μL 反应体系）加入PCR 管中即可进行PCR，反应结束后直接取5-15 μL 电泳检查扩增结果。如果反应体系不是30 μL，各成分需要按比例增加或减少。

2×高保真 PCR MagicMix	15μL
DNA模板(自备)
哺乳动物基因组DNA	0.5-1μg
酵母基因组DNA	5-500ng
细菌基因组DNA	0.5-50ng
质粒DNA	5-500ng
PCR 回收片段	1-100pg
PCR 引物(自备)	10-20 pmol each
补水到	30μL

放入PCR 仪中进行PCR, 结束后取5-10 μL 直接上样电泳, 红色染料电泳速度相当于50 bp DNA 片段。
参考扩增条件：

预变性	94℃	4 min
PCR (30个循环)	94℃	30s
	50℃	30s
	68℃	0.5kb/min
延伸	68℃	10 min

注意：
1.本产品的Pfu DNA 聚合酶比Taq DNA 聚合酶的延伸反应速率低，因此我们推荐的扩增延伸反应时间为每kb 需2 分种。
2. Pfu 酶3’-5’外切酶活性可降解引物，所以强烈建议在冰上配置完成PCR反应液后，立即放入PCR 仪中进行扩增，扩增完毕后立即进行电泳检测。
3.本产品扩增产物为平末端，不可以直接进行TA 克隆，可以使用克必隆B载体(BTN51104)进行克隆。如需要进行TA克隆，建议对PCR 产物纯化后，用加A 试剂盒(BTN60105)加A 后再进行TA克隆。
4.由于Pfu 无 5’到 3’外切酶的活性，所以本试剂盒不能用于实时荧光PCR。
疑难解答：
Q：为何Pfu DNA Polymerase 扩增效率不如Taq DNA Polymerase？
A：一是由于Pfu DNA Polymerase 具有3’-5’的外切活性，所以在合成过程中，该酶会随时校对新添加的核苷酸是否配对，影响了合成效率；二是它能通过3’-5’的外切活性使引物部分降解，降低引物结合模板的能力，进而影响扩增效率。三是上面提到的尿嘧叮抑制作用。
Q：使用本产品时还有哪些注意事项？
A：1.引物长度和浓度一般应比常规的PCR 长和高（考虑到被Pfu DNA Polymerase的3’-5’的外切活性降解的因素）；2.最好在反应前加Pfu DNA Polymerase。