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BTN91108 T3体外转录试剂盒
发布时间：2017-10-01 10:20 | 点击次数：243
T3体外转录试剂盒说明书
产品编号：BTN91108
规格：50T
产品及特点：
本试剂盒是基于沙门氏噬菌体T3 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒，它利用含有T3启动子的模版DNA，以NTP为底物，从T3启动子下游开始合成与模板DNA中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA分子。本产品具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需提供含T3启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验，不需耍单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3. 模板DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。
4. 可以合成的RNA的最佳长度在20 nt到5000 nt之问。
5. 产品配方经过精心优化，每μg DNA模板可以合成2-6 μg RNA。
6. 得到的RNA可以用于RNA结构研究、核解生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和RNA干扰（RNAi）等实验。
规格及成分：
保存条件：
低温运输，-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂：
如果需要去除转录产物中的DNA模板，则需要RNase-free DNase 、Tris饱和酚、氯仿、微量核酸沉淀剂、RNase-free 75%乙醇（均可从本公司另购）。
使用方法：
一、制备DNA模板
PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。一是必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。二是需要转录的DNA序列的上游必须有T3启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将T3启动子序列（5’AATTAACCCTCACTAAAGG 3’）加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T3启动子的载体，并且克隆位点必须位于T3启动子下游。三是需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3’突出。如果是3’突出（如选择了Pst I来线性化质粒），则最好用T4 DNA聚合酶修平。四是必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。
二、体外转录反应
1. 在一个RNase-free 的塑料离心管中，在室温下（不是在4℃下）按次序加入下列成分：
注：此为20uL反应体系的用量，对其他体积的反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记RNA探针，则需要定做NTP分开而不是NTP预先混合的试剂盒。如果需要得到加帽RNA，则需要加入自备的加帽修饰核苷酸（本公司有各种加帽修饰核苷酸）。
2. 37℃保温1-2小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热10分钟灭活T3 RNA聚合酶。
4. 取1-3μL电泳检测转录效果。一般1 μg DNA可以合成 5-10 μg的RNA。
5. 得到的RNA可以放-80℃保存。
注：若需进一步去除DNA模板，可参考下列操作步骤，但所用试剂需另行购买，本试剂盒不提供。
1. 在体外转录结束后，在反应体系中加入3-5 U自备的 RNase-free DNase（BTN90903；3-5 U/uL）。
2. 37℃保温15-30分钟。
3. 补水到100μL，
4. 用自备的等体积（100μL）的Tris饱和酚-氯仿抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。
5. 在上清中加200μL自备的微量核酸沉淀剂（BTN50903；用前需要摇晃混匀），振荡后15000 rpm离心3-5分钟，弃上清。
6. 加入1 mL 75%乙醇，震荡10秒后15000 rpm离心3-5分钟，弃上清。
7. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。
8. 晾干半分钟，所得沉淀即去除DNA模板后的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。
疑难解答：
1、没有RNA产物。最常见原因是DNA模板有RNase污染，测试方法是用纯化的RNA跟模板DNA一起保温，再检测RNA是否降解。本试剂盒缓冲液和酶混合液中有RNase inhibitor，如果模板RNase污染严重，可能需要用户补加RNase inhibitor。
2、RNA产量低。最常见的原因是DNA模板序列。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G，在前14个碱基内避免有U存在。
3、RNA长度比预期的短。可能是模板序列中有T3 RNA聚合酶的终止序列。可以改用SP6或T7体外转录试剂盒（启动子也必须改成SP6或T7启动子）。
4、RNA长度比预计的长。T3 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，最多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒DNA，则可能是质粒DNA线性化不彻底。
5、5’单磷酸还是三磷酸。如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长（如12小时），则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则T3 RNA聚合酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5’端是单磷酸的比例将大大增加。
产品编号：BTN91108
规格：50T
产品及特点：
本试剂盒是基于沙门氏噬菌体T3 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒，它利用含有T3启动子的模版DNA，以NTP为底物，从T3启动子下游开始合成与模板DNA中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA分子。本产品具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需提供含T3启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验，不需耍单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3. 模板DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。
4. 可以合成的RNA的最佳长度在20 nt到5000 nt之问。
5. 产品配方经过精心优化，每μg DNA模板可以合成2-6 μg RNA。
6. 得到的RNA可以用于RNA结构研究、核解生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和RNA干扰（RNAi）等实验。
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| 转录预配液（2×） | 0.5mL |
| 阳性对照DNA（1.3 Kb片段） | 20μL（10ng/μL） |
| T3 RNA聚合酶混合液 | 50μL |
| RNase-free水 | 1mL |
| 说明书 | 1份 |
低温运输，-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂：
如果需要去除转录产物中的DNA模板，则需要RNase-free DNase 、Tris饱和酚、氯仿、微量核酸沉淀剂、RNase-free 75%乙醇（均可从本公司另购）。
使用方法：
一、制备DNA模板
PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。一是必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。二是需要转录的DNA序列的上游必须有T3启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将T3启动子序列（5’AATTAACCCTCACTAAAGG 3’）加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T3启动子的载体，并且克隆位点必须位于T3启动子下游。三是需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3’突出。如果是3’突出（如选择了Pst I来线性化质粒），则最好用T4 DNA聚合酶修平。四是必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。
二、体外转录反应
1. 在一个RNase-free 的塑料离心管中，在室温下（不是在4℃下）按次序加入下列成分：
| 成分 | 加入量 | 备注 |
| DNA模板 | xμl | 总量在50 ng-1 μg（如果模板是PCR片段，建议用50 ng左右；如果模板是质粒DNA，建议用1 μg左右；如果用本产品提供的阳性对照，建议用4μL） |
| 转录预配液，2× | 10μl | 需室温时使用 |
| T3 RNA聚合酶混合液 | 1μl | 本成分还含其他促进剂，所以是混合物 |
| RNase-free水 | 补水到20μL |
2. 37℃保温1-2小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热10分钟灭活T3 RNA聚合酶。
4. 取1-3μL电泳检测转录效果。一般1 μg DNA可以合成 5-10 μg的RNA。
5. 得到的RNA可以放-80℃保存。
注：若需进一步去除DNA模板，可参考下列操作步骤，但所用试剂需另行购买，本试剂盒不提供。
1. 在体外转录结束后，在反应体系中加入3-5 U自备的 RNase-free DNase（BTN90903；3-5 U/uL）。
2. 37℃保温15-30分钟。
3. 补水到100μL，
4. 用自备的等体积（100μL）的Tris饱和酚-氯仿抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。
5. 在上清中加200μL自备的微量核酸沉淀剂（BTN50903；用前需要摇晃混匀），振荡后15000 rpm离心3-5分钟，弃上清。
6. 加入1 mL 75%乙醇，震荡10秒后15000 rpm离心3-5分钟，弃上清。
7. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。
8. 晾干半分钟，所得沉淀即去除DNA模板后的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。
疑难解答：
1、没有RNA产物。最常见原因是DNA模板有RNase污染，测试方法是用纯化的RNA跟模板DNA一起保温，再检测RNA是否降解。本试剂盒缓冲液和酶混合液中有RNase inhibitor，如果模板RNase污染严重，可能需要用户补加RNase inhibitor。
2、RNA产量低。最常见的原因是DNA模板序列。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G，在前14个碱基内避免有U存在。
3、RNA长度比预期的短。可能是模板序列中有T3 RNA聚合酶的终止序列。可以改用SP6或T7体外转录试剂盒（启动子也必须改成SP6或T7启动子）。
4、RNA长度比预计的长。T3 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，最多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒DNA，则可能是质粒DNA线性化不彻底。
5、5’单磷酸还是三磷酸。如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长（如12小时），则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则T3 RNA聚合酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5’端是单磷酸的比例将大大增加。
- 如何得到带帽RNA？