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BTN100204 一站式PCR-SSCP套装
发布时间：2017-10-01 10:23 | 点击次数：264
一站式PCR-SSCP套装说明书
产品编号：BTN100204
规格：1套
产品及特点：
聚合酶链式反应-单链构象多态（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）技术是在PCR技术基础上发展起来的、用来寻找单碱基突变（点突变）的手段。它简单、快速、经济，已被广泛用于癌基因和抑癌基因点突变的筛查、遗传性致病基因的分析、基因诊断和基因制图等领域。本产品具有下列特点：
1. 一站式，用户只需要提供模板和引物，不需要准备其他试剂。
2. 使用高保真DNA 聚合酶，减少了在PCR过程中引入突变的可能。
3. 凡是可以用做PCR模板额材料都可用本产品做SSCP 分析。
4. 提供对照样品，便于在实验遇到困难时分析原因。
5. 使用银染，免去使用同位素的危害。
规格及成分：
保存条件：
常温运输和保存，PCR Mix 2.0 需要低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
去离子水、超纯水。
使用方法：
一：PCR 及产物准备
1. 根据突变位点的位置设计引物。用于SSCP 分析的PCR 产物长度最好在200-400 bp，否则分辨率会有所降低。
2. 按下表设置PCR 反应：
3. PCR 产物纯化。PCR 产物必须经过柱式法纯化（试剂需要另购），电泳检无杂带，否则残留引物会跟变性后的DNA 单链复性，干扰SSCP 电泳。
将一部分纯化产物用超纯水分别稀释3、6、9 倍后备用。
4. PCR 片段的变性。将PCR 纯化产物原液和3、6、9 倍稀释液分别按1:1的比例与SSCP-PAGE 上样液混合，100℃加热5分钟后放冰上待用。
二： PAGE 参数的选择
6. SSCP PAGE 交联度的选择：交联度越低，孔径越大，对DNA 分子构象的变化越灵敏，SSCP 分辨率越高。但过低则胶太软，不好进行电泳后的后续操作，所以一般首先选择1-2%的交联度（即丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺在49:1 到48:2 之间），效果不好时再试29:1、66:1、99:1 等比例。
7. 胶板的选择：SSCP PCR 检测最好使用长约30-40 cm 的测序胶板，至少也需要长为16 cm 的胶板，否则各种构型的单链DNA 不能充分分离。
三：配胶操作（以配制100 mL 胶为例，配制更大体积需按比例调整）
8. 新鲜配制10%的APS（过硫酸铵）：按每0.1 克过硫酸铵干粉加1mL 超纯水的比例将大约0.1g 硫酸铵干粉在EP 管中溶解。配制好的10%的APS 溶液可以在4℃存放一周。
9. 新鲜配制丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液：将越160 mL 去离子水加入到装有60 克丙烯酰胺干粉的250 mL 塑料瓶中，充分摇晃直到干粉溶解，得到30%的丙烯酰胺溶液。如果要配制C=2%的胶（相当于丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=49:1），则加入1.2 g 甲叉双丙烯酰胺(相当于60 克丙烯酰胺的1/50)，即得49:1 的丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺溶液（AB 溶液，下同）。配制其他交联度的溶液按上述方法计算所需甲叉双丙烯酰胺的量。
10. 配SSCP PAGE 胶：在一个250 mL 的三角瓶中，先按下表的用量加入去离子水、30% AB 溶液和10×TBE 缓冲液。丙烯酰胺单体溶液具有神经毒性，一定要戴手套操作。
注：有大量文献报道PAGE 胶中加入5%-10%的甘油能提高某些位点的分辨率。用户最好做两块胶，一块加一块不加甘油，如果加则减少去离子水的用量10 mL，同时加入10 mL 自备甘油。
11. 摇晃混匀。最好能抽真空10-15分钟以去除溶液中的氧气（氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应），无条件也可以不脱氧。
12. 加入500 μL 10%APS 和100-300 μL TEMED，迅速摇匀后倒胶。
13. 在胶的液面距离达到顶部时停止灌胶，插入梳子。
14. 室温聚合30-60分钟（低温抑制聚合反应）。
15. 拔出梳子，用1×TEB 液冲洗加样孔。
16. 放4℃冰箱预冷30分钟-12小时（最好过夜）。为了防止胶收缩，最好顶部加少量1×TBE 缓冲液。预冷的胶有利于保持单链DNA 的构型。
17. 将预冷的凝胶板固定在电泳装置上，往上下槽中加入1×TEB 电泳液。
18. 取3-5 μL 变性后的4 个不同稀释度的PCR 样品直接上样。
19. 连接电源线，打开电源开关。如果PAGE 中不含甘油，则使用25W 的功率，电泳5-7小时（对3-40 cm 长的PAGE 胶而言）。如果使用含甘油的PAGE，则使用8W 的功率，电泳16-18小时。由于温度变化过大会改变DNA 构型，所以电泳时最好能保持恒温。对不含甘油的PAGE，最好恒温在4℃、对含甘油的PAGE，最好恒温在25℃。
20. 终止电泳，取出凝胶进行后续的处理（如银染）。
四：银染（见超快核酸银染试剂盒使用说明书）
产品编号：BTN100204
规格：1套
产品及特点：
聚合酶链式反应-单链构象多态（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）技术是在PCR技术基础上发展起来的、用来寻找单碱基突变（点突变）的手段。它简单、快速、经济，已被广泛用于癌基因和抑癌基因点突变的筛查、遗传性致病基因的分析、基因诊断和基因制图等领域。本产品具有下列特点：
1. 一站式，用户只需要提供模板和引物，不需要准备其他试剂。
2. 使用高保真DNA 聚合酶，减少了在PCR过程中引入突变的可能。
3. 凡是可以用做PCR模板额材料都可用本产品做SSCP 分析。
4. 提供对照样品，便于在实验遇到困难时分析原因。
5. 使用银染，免去使用同位素的危害。
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| PCR Magic Mix 2.0(不含染料) | 1.5ml |
| 丙烯酰胺 | 60g |
| 甲叉双丙烯酰胺 | 3g |
| TEMED | 1.5ml |
| 过硫酸铵 | 1g |
| SSCP-PAGE 上样液 | 1ml |
| TBE 电泳液，10× | 250ml |
| 溶液A 组分一（干粉） | 2g |
| 溶液A 组分二，10× | 100ml |
| 溶液A 组分三，10× | 100ml |
| 溶液B 组分一，10× | 100ml |
| 溶液B 组分二 | 5ml |
| 说明书 | 1份 |
常温运输和保存，PCR Mix 2.0 需要低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
去离子水、超纯水。
使用方法：
一：PCR 及产物准备
1. 根据突变位点的位置设计引物。用于SSCP 分析的PCR 产物长度最好在200-400 bp，否则分辨率会有所降低。
2. 按下表设置PCR 反应：
| 成分 | 用量 |
| PCR Mix 2.0 | 15μl |
| 自备模板DNA | 10-500 ng |
| 自备引物一 | 1 μl（10 pmol/μl） |
| 自备引物二 | 1 μl（10 pmol/μl） |
| 补超纯水到 | 30 μl |
| PCR 循环参数根据引物和模板情况决定。 | |
将一部分纯化产物用超纯水分别稀释3、6、9 倍后备用。
4. PCR 片段的变性。将PCR 纯化产物原液和3、6、9 倍稀释液分别按1:1的比例与SSCP-PAGE 上样液混合，100℃加热5分钟后放冰上待用。
二： PAGE 参数的选择
- 根据PCR 产物长度按下表选择SSCP PAGE 的浓度：
| PCR 产物长度 | SSCP PAGE 胶最适浓度 |
| 80-500 bp | 5% |
| 60-400 bp | 8% |
| 40-200 bp | 12% |
7. 胶板的选择：SSCP PCR 检测最好使用长约30-40 cm 的测序胶板，至少也需要长为16 cm 的胶板，否则各种构型的单链DNA 不能充分分离。
三：配胶操作（以配制100 mL 胶为例，配制更大体积需按比例调整）
8. 新鲜配制10%的APS（过硫酸铵）：按每0.1 克过硫酸铵干粉加1mL 超纯水的比例将大约0.1g 硫酸铵干粉在EP 管中溶解。配制好的10%的APS 溶液可以在4℃存放一周。
9. 新鲜配制丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液：将越160 mL 去离子水加入到装有60 克丙烯酰胺干粉的250 mL 塑料瓶中，充分摇晃直到干粉溶解，得到30%的丙烯酰胺溶液。如果要配制C=2%的胶（相当于丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=49:1），则加入1.2 g 甲叉双丙烯酰胺(相当于60 克丙烯酰胺的1/50)，即得49:1 的丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺溶液（AB 溶液，下同）。配制其他交联度的溶液按上述方法计算所需甲叉双丙烯酰胺的量。
10. 配SSCP PAGE 胶：在一个250 mL 的三角瓶中，先按下表的用量加入去离子水、30% AB 溶液和10×TBE 缓冲液。丙烯酰胺单体溶液具有神经毒性，一定要戴手套操作。
| PAGE胶浓度 | 各成分用量（单位：mL） | 总体积（mL） | ||
| 去离子水 | 30%丙烯酰胺 | 10×TBE | ||
| 5% | 73.3 | 16.7 | 10.0 | 100 |
| 8% | 63.3 | 26.7 | 10.0 | 100 |
| 12% | 50.0 | 40.0 | 10.0 | 100 |
11. 摇晃混匀。最好能抽真空10-15分钟以去除溶液中的氧气（氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应），无条件也可以不脱氧。
12. 加入500 μL 10%APS 和100-300 μL TEMED，迅速摇匀后倒胶。
13. 在胶的液面距离达到顶部时停止灌胶，插入梳子。
14. 室温聚合30-60分钟（低温抑制聚合反应）。
15. 拔出梳子，用1×TEB 液冲洗加样孔。
16. 放4℃冰箱预冷30分钟-12小时（最好过夜）。为了防止胶收缩，最好顶部加少量1×TBE 缓冲液。预冷的胶有利于保持单链DNA 的构型。
17. 将预冷的凝胶板固定在电泳装置上，往上下槽中加入1×TEB 电泳液。
18. 取3-5 μL 变性后的4 个不同稀释度的PCR 样品直接上样。
19. 连接电源线，打开电源开关。如果PAGE 中不含甘油，则使用25W 的功率，电泳5-7小时（对3-40 cm 长的PAGE 胶而言）。如果使用含甘油的PAGE，则使用8W 的功率，电泳16-18小时。由于温度变化过大会改变DNA 构型，所以电泳时最好能保持恒温。对不含甘油的PAGE，最好恒温在4℃、对含甘油的PAGE，最好恒温在25℃。
20. 终止电泳，取出凝胶进行后续的处理（如银染）。
四：银染（见超快核酸银染试剂盒使用说明书）