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BTN100205 一站式DNA非变性PAGE电泳套装
发布时间：2017-10-01 10:28 | 点击次数：305
一站式DNA非变性PAGE电泳套装说明书
产品编号：BTN100205
规格：30T
产品及特点：
非变性PAGE电泳是研究SSCP-PCR（single-strand conformation polymorphism-PCR、单链PCR片段构象多态性）和凝胶滞阻（Gel Shift）的重要研究手段，因为在非变性PAGE中， DNA的迁移率除跟长短相关外，还跟其构象和结合的蛋白质相关。本产品就是专门用于非变性PAGE的试剂，它具有下列特点:
1. 一站式，用户只需要准备水和样品，十分方便。
2. 安全，免去了实验人员接触粉末状的剧毒物品丙烯酰胺。
3. 灵活，高浓度的丙烯酰胺溶液可用于配制各种浓度的PAGE胶，分开提供的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺可用于配制各种交联度的PAGE胶。
4. PAGE电泳后可直接用于银染等后续试验。
规格及成分：
保存条件：
常温运输，保存条件见上表，有效期一年。
自备试剂：
去离子水。
使用方法：
用于SSCP-PCR分析的非变性PAGE电泳（其他应用请相应修改参数）
一、PAGE浓度的选择：最好使用浓度为5-12%的丙烯酰胺胶，因为SSCP-PCR的扩增长度一般在150-200bp之间，而5%的PAGE的有效分辨范围为80-500bp、8%的PAGE的有效分辨范围为60-400bp、12%的PAGE的有效分辨范围为40-200bp。
二、PAGE交联度的选择：交联度越低，孔径越大，对DNA分子构象的变化越灵敏，SSCP分辨率越高，但过低则胶太软，不好进行电泳后的后续操作，所以一般选择1-2%的交联度（即丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺在49:1到48:2之间）。
三、体积的选择：SSCP-PCR检测需要长约30-40cm的测序胶板，可以结合梳子的厚度，计算胶的体积。
操作：
1. 配制PAGE胶（这是配制100 mL胶的用量，配制更大体积的胶则需以此用量为基础按比例增加）
A：新鲜配制10%的APS（过硫酸铵）：按每0.1克过硫酸铵干粉加1mL超纯水的比例将水加到装有硫酸铵干粉的1.5 mL EP管中，摇晃到粉末全部溶解。配制好的10%的APS溶液可以在4℃存放一周。
B：新鲜配制适当交联度29:1的30%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液（AB溶液，下同）：在本产品提供的装有60 g丙烯酰胺干粉的塑料瓶中加入146 mL自备的去离子水和全部的甲叉双丙烯酰胺，充分摇晃直到溶解（约需10-20分钟），即得到30%的AB（29:1）溶液。此溶液最好在一个月内用完，必须4℃避光保存。
C：配SSCP PAGE胶：在一个250mL的三角瓶中，先按下表的用量加入去离子水、30% AB 溶液溶液和10×TBE缓冲液。丙烯酰胺单体溶液具有神经毒性，一定要戴手套操作。
注：有大量文献报道PAGE胶中加入5%-10%的甘油能提高某些位点的分辨率。如果选择加入10%的甘油，则减少去离子水的用量10mL，同时加入10mL甘油。
C：摇晃混匀。最好能抽真空10-15分钟以去除溶液中的氧气（氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应），无条件也可以不脱氧。
D：加入500μL 10%APS和100μL TEMED，迅速摇匀后倒胶。
E: 在胶的液面距离达到顶部时停止灌胶，插入梳子。
F: 室温聚合30-60分钟（低温抑制聚合反应）。
G: 拔出梳子，用1×TEB液冲洗加样孔。
H: 放4℃冰箱预冷30分钟-12小时。为了防止胶收缩，最好顶部加少量1×TBE缓冲液。预冷的胶有利于保持单链DNA的构型。
2. 将预冷的凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入足够1×TEB电泳液。
3. 取3-5 μL SSCP-PCR样品，加入等体积2×非变性PAGE上样液，85℃处理5分钟后冰浴。用前短暂离心后取2 μL上样。
4. 连接电源线，打开电源开关。如果PAGE中不含甘油，则使用25W的功率，电泳5-7小时（对3—40cm长的PAGE胶而言）。如果使用含甘油的PAGE，则使用8W的功率，电泳16-18小时。由于温度变化过大会改变DNA构型，所以电泳时最好能保持恒温。对不含甘油的PAGE，最好恒温在4℃、对含甘油的PAGE，最好恒温在25℃。
5. 终止电泳，取出凝胶进行后续的处理（如银染）。
疑难解答：
一、为何SSCP-PCR带型有复合条带？
原因之一：可能是残留的PCR引物跟单链的DNA结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。
原因之二：可能是PCR产物用量过高，彼此复性。解决办法是将PCR产物稀释后4-8倍后使用。
二、如何提高电泳分辨率？
可以在配胶时加入甘油（终浓度为5%-10%），因为甘油是弱变性剂，能部分展开DNA折叠结构，增加表面积，增加电泳时位移差异。但加入甘油后粘性变大，电泳速度变慢，因此只适合室温电泳使用，不要4℃电泳。如果条件允许，最好同时做加甘油和不加甘油的电泳实验。
产品编号：BTN100205
规格：30T
产品及特点：
非变性PAGE电泳是研究SSCP-PCR（single-strand conformation polymorphism-PCR、单链PCR片段构象多态性）和凝胶滞阻（Gel Shift）的重要研究手段，因为在非变性PAGE中， DNA的迁移率除跟长短相关外，还跟其构象和结合的蛋白质相关。本产品就是专门用于非变性PAGE的试剂，它具有下列特点:
1. 一站式，用户只需要准备水和样品，十分方便。
2. 安全，免去了实验人员接触粉末状的剧毒物品丙烯酰胺。
3. 灵活，高浓度的丙烯酰胺溶液可用于配制各种浓度的PAGE胶，分开提供的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺可用于配制各种交联度的PAGE胶。
4. PAGE电泳后可直接用于银染等后续试验。
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| 丙烯酰胺 | 60g |
| 甲叉双丙烯酰胺 | 2g |
| TEMED | 1.5ml |
| 过硫酸铵（干粉） | 1g |
| 非变性PAGE上样液，2× | 1ml |
| 10×TBE | 250ml |
| 说明书 | 1份 |
保存条件：
常温运输，保存条件见上表，有效期一年。
自备试剂：
去离子水。
使用方法：
用于SSCP-PCR分析的非变性PAGE电泳（其他应用请相应修改参数）
一、PAGE浓度的选择：最好使用浓度为5-12%的丙烯酰胺胶，因为SSCP-PCR的扩增长度一般在150-200bp之间，而5%的PAGE的有效分辨范围为80-500bp、8%的PAGE的有效分辨范围为60-400bp、12%的PAGE的有效分辨范围为40-200bp。
二、PAGE交联度的选择：交联度越低，孔径越大，对DNA分子构象的变化越灵敏，SSCP分辨率越高，但过低则胶太软，不好进行电泳后的后续操作，所以一般选择1-2%的交联度（即丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺在49:1到48:2之间）。
三、体积的选择：SSCP-PCR检测需要长约30-40cm的测序胶板，可以结合梳子的厚度，计算胶的体积。
操作：
1. 配制PAGE胶（这是配制100 mL胶的用量，配制更大体积的胶则需以此用量为基础按比例增加）
A：新鲜配制10%的APS（过硫酸铵）：按每0.1克过硫酸铵干粉加1mL超纯水的比例将水加到装有硫酸铵干粉的1.5 mL EP管中，摇晃到粉末全部溶解。配制好的10%的APS溶液可以在4℃存放一周。
B：新鲜配制适当交联度29:1的30%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液（AB溶液，下同）：在本产品提供的装有60 g丙烯酰胺干粉的塑料瓶中加入146 mL自备的去离子水和全部的甲叉双丙烯酰胺，充分摇晃直到溶解（约需10-20分钟），即得到30%的AB（29:1）溶液。此溶液最好在一个月内用完，必须4℃避光保存。
C：配SSCP PAGE胶：在一个250mL的三角瓶中，先按下表的用量加入去离子水、30% AB 溶液溶液和10×TBE缓冲液。丙烯酰胺单体溶液具有神经毒性，一定要戴手套操作。
| PAGE胶浓度 | 各成分用量（单位：ml） | 总体积（ml） | ||
| 去离子水 | 30%AB溶液 | 10×TBE缓冲液 | ||
| 5% | 73.4 | 16.6 | 10.0 | 100 |
| 6% | 70.0 | 20.0 | 10.0 | 100 |
| 7% | 66.7 | 23.3 | 10.0 | 100 |
| 8% | 63.3 | 26.7 | 10.0 | 100 |
| 9% | 60.0 | 30.0 | 10.0 | 100 |
| 10% | 56.7 | 33.3 | 10.0 | 100 |
| 11% | 53.3 | 36.7 | 10.0 | 100 |
| 12% | 50.0 | 40.0 | 10.0 | 100 |
C：摇晃混匀。最好能抽真空10-15分钟以去除溶液中的氧气（氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应），无条件也可以不脱氧。
D：加入500μL 10%APS和100μL TEMED，迅速摇匀后倒胶。
E: 在胶的液面距离达到顶部时停止灌胶，插入梳子。
F: 室温聚合30-60分钟（低温抑制聚合反应）。
G: 拔出梳子，用1×TEB液冲洗加样孔。
H: 放4℃冰箱预冷30分钟-12小时。为了防止胶收缩，最好顶部加少量1×TBE缓冲液。预冷的胶有利于保持单链DNA的构型。
2. 将预冷的凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入足够1×TEB电泳液。
3. 取3-5 μL SSCP-PCR样品，加入等体积2×非变性PAGE上样液，85℃处理5分钟后冰浴。用前短暂离心后取2 μL上样。
4. 连接电源线，打开电源开关。如果PAGE中不含甘油，则使用25W的功率，电泳5-7小时（对3—40cm长的PAGE胶而言）。如果使用含甘油的PAGE，则使用8W的功率，电泳16-18小时。由于温度变化过大会改变DNA构型，所以电泳时最好能保持恒温。对不含甘油的PAGE，最好恒温在4℃、对含甘油的PAGE，最好恒温在25℃。
5. 终止电泳，取出凝胶进行后续的处理（如银染）。
疑难解答：
一、为何SSCP-PCR带型有复合条带？
原因之一：可能是残留的PCR引物跟单链的DNA结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。
原因之二：可能是PCR产物用量过高，彼此复性。解决办法是将PCR产物稀释后4-8倍后使用。
二、如何提高电泳分辨率？
可以在配胶时加入甘油（终浓度为5%-10%），因为甘油是弱变性剂，能部分展开DNA折叠结构，增加表面积，增加电泳时位移差异。但加入甘油后粘性变大，电泳速度变慢，因此只适合室温电泳使用，不要4℃电泳。如果条件允许，最好同时做加甘油和不加甘油的电泳实验。