BTN100302 包涵体蛋白溶解及复性套装

包涵体蛋白溶解及复性套装说明书
产品编号：BTN100302
规格：100T
产品及特点：
本产品用E.coli作为宿主表达得到的重组蛋白往往会形成包涵体，其中的重组蛋白质只完成部分折叠，还没形成最后的正确空间结构，所以没有生物活性，要得到有活性的重组蛋白，还需要后续的溶解和复性（重折叠）处理。目前最常用的溶解包涵体的方法是用尿素，Sarkosyl，盐酸胍等强变性剂，其缺点是包涵体中的重组蛋白质被彻底变性，使后续的蛋白质复性处理效率降低。本产品根据包涵体中的重组蛋白质已经完成了部分折叠这一实事设计，具有下列特点：
1. 一站式，提供包涵体洗涤、溶解和蛋白质复性的所有试剂。
2. 采用温和法溶解包涵体，释放的包涵体蛋白质不彻底变性，还能保持其部分折叠的结构，使后续的复性处理效率提高。
3. 所用复性液基于稀释复性，经过精心优化，有利于大部分蛋白的复性。
4. 还提供五种不同的添加剂，它们可以单独加入复性液，也可以按一定比例进行自由组合，以适应不同的蛋白质折叠需求。
5. 本试剂盒提供实惠的小规格，用于做预实验用，用户如果选择到合适的溶液组合后，可以单独购买其中的溶液以用于大量制备。
6. 本试剂盒足够100次小规模（1mL规模）的蛋白质复性实验。
规格及成分：

成分	规格
包涵体洗涤液	250mL
包涵体温和溶解液（10种各一套）	10×10ml
包涵体蛋白质复性液	250ml
说明书	1份

保存条件：
常温运输和保存，有效期一年。
自备试剂：
去离子水、BCA蛋白浓度测定试剂盒、0.22 μm注射器式滤膜。
使用方法：
一、洗涤包涵体
说明：用常规方法得到的包涵体常常含有去污剂和细胞碎片，因此需要经过充分的洗涤才能用于本实验。
1. 将10mg包涵体沉淀溶解在5mL包涵体洗涤液中，超声波处理8次或充分吹打混匀。可以适当留取10-30μL作为SDS-PAGE电泳样品待用。
2. 4℃ 12000 rpm离心20分钟后弃上清。
3. 重复上面的洗涤步骤3次，每次留取10-30μL作为SDS-PAGE电泳样品待用。
4. 将包涵体沉淀溶解在1 mL包涵体洗涤液中，超声波处理8次或充分吹打混匀。
5. 检查包涵体的纯度：将上步得到的包涵体溶液和前几步得到的预留样品一起用于SDS-PAGE电泳，检查每次洗涤去除杂带的情况。
6. 检查包涵体的浓度：用自备的BCA蛋白检测试剂盒测试第4步得到的包涵体溶液的蛋白质浓度。
7. 将第4步得到的包涵体溶液的蛋白质浓度调到5-10 mg/mL(如果低于此范围，则离心后用适量的洗涤液再溶解；如果高于此范围，则用洗涤液稀释)，然后均分到10个1.5 mL塑料离心管中，每管100 μL。
8. 4℃ 12000 rpm离心20分钟后弃上清。
9. 所得沉淀即纯化的待用的包涵体。
二、确定溶解包涵体的最佳条件：
1. 标记上步得到的10个离心管，并分别加入10种包涵体温和溶解液，每种1 mL。注意：准确记录它们的对应关系。
2. 充分振荡后，室温放置30分钟。
3. 450 nm检测浑浊度并记录下数据。
4. 4℃ 12000 rpm离心10分钟后收集上清，此即包涵体溶解液。
5. 用0.22 μm注射器式滤膜过滤包涵体溶解液。
6. 280 nm检测包涵体溶解液的光吸收。
7. 溶解液溶解包涵体能力跟包涵体溶液浊度跟成反比，跟包涵体溶解液中OD280数值成正比。根据上面的数据即可确定哪种溶解液对实验中所用包涵体具有最佳溶解能力，并将在此溶解液中溶解的包涵体溶解液用于下面的复性实验。大量处理需要从本公司单独大量订购包涵体温和型溶解液10种中的1种。
三．包涵体蛋白的复性：
1. 在2.5 mL 4℃预冷的、处于轻柔搅拌中的复性缓冲液中，逐滴加入上步得到的包涵体溶解液。
2. 待所有包涵体溶解液都加完后，将包涵体蛋白复性溶液用孔径为0.22 μm注射器式滤膜过滤，除去包涵体（直径一般在0.5-0.8 μm）和大的聚合物。
3. 将得到的溶液用于活性检测或离子交换柱层析和分子筛层析。