BTN100502 高效E.coli感受态细胞制备试剂盒

高效E.coli感受态细胞制备试剂盒说明书
产品编号：BTN100502
规格：20T
产品及特点：
本试剂盒是基于Inoue 方法的、高效快速E.coli感受态细胞制备试剂盒。
本产品具有下列特点：
1. 一步式操作，离心后重悬细胞即可，非常简单。
2. 转化率高，转化效率一般都在10E8/ug 质粒以上。
3. 重复性好，可用于各种E.coli 菌种，包括K12系（如JM109、DH5a等）和B 系（如BL21 系列菌种）。
4. 适用于低、中、高拷贝的各种质粒。
5. 本试剂盒足够20 次制备，每次可以制备可以用50 mL 菌液制备80管感受态细胞。所得感受态细胞在-80℃至少可以保存半年以上。
格及成分：

成分	规格
溶液A	250ml×2
溶液B	6ml
说明书	1份

保存条件：
低温运输，4℃保存（开封后请-20℃保存，防止污染），有效期一年。
自备试剂：
无菌超纯水，SOB 和SOC 液体培养基，相关抗菌素。
使用方法：
1. 划盘，过夜培养出单菌落。
2. 次日下午，接种一个单个直径为2-3 毫米的菌落到1 mL 不含抗生素的SOB 液体培养基中，37℃ 220rpm 摇晃过夜培养。
3. 次日早上，将20 μL 上步得到的菌液接种到2 mL SOB 液体培养基中，37℃ 250-300 rpm 摇晃培养3小时。此时菌液将轻微浑浊。
4. 将 1 mL 上步得到的菌液接种到50 mL SOB 液体培养基中（用250 mL三角瓶），用户也可以分别接种1mL，0.5 mL 和0.25 mL 到3 个50 mL的SOB液体培养基中，这样2-3小时测OD时总有一瓶OD会在0.3-0.4，避免了多次测OD 可能带来的污染。
5. 室温或 18℃ 250-300 rpm 摇晃培养2-3小时，直到OD600 在0.3-0.4之间。注意：确保室温或18℃培养非常重要，在此温度下细菌D600达到0.3-0.4 所需时间跟菌种不同而不同。
6. 将菌液放置在冰上10分钟。同时预冷下步要用的50 mL 无菌离心管和20 mL 溶液A。所需冷冻离心机也最好开启制冷。
7. 将 50 mL 菌液转移到2 个预冷的无菌离心管中，每管25mL。在冷冻离心机上4ºC 3000g 离心10分钟，弃上清。注意：必须低温离心，否则转化效率将减低100 倍。
8. 再在4ºC 3000g 短暂离心半分钟，用移液枪小心吸出残留液体。注意：残留上清必须彻底去除，否则会影响感受态效率。
9. 在沉淀中加入20 mL 预冷的溶液A，轻弹离心管底轻柔重悬菌体。注意：不要涡旋振荡。
10. 冰上放置5分钟。期间预冷4.3 mL 新鲜配制的感受态活化液（4 mL 溶液A+0.3 mL 溶液B，充分混匀后放冰上）和装感受态细胞所需的无菌塑料离心管。
11. 4ºC 3000g 离心10分钟，弃上清。
12. 在沉淀中加入4 mL 第9 步预冷的感受态活化液，重悬细菌后冰上放置10分钟。
13. 按 50 μL/管分装到预冷的无菌塑料离心管中。此时细胞将处于感受态，可以直接用于转化，也可立即放到-80℃保存。50 mL 菌液一次可以制备80 管感受态细胞。
二：转化步骤
14. 将冻存的感受态细胞置于冰中解冻。
15. 加入 1-5 μL 质粒（100pg-10ng）或1-5 μL 连接反应液。用加DNA的移液器轻柔吹打混匀，不要涡旋震荡。
16. 冰浴 15-30分钟。期间可以37ºC 预热1 mL 自备的、不含抗菌素液体培养基（此处最好用SOB，因为LB 培养基将降低转化率）。
17. 42ºC 热激60 秒后冰浴1-2分钟。
18. 加入 1 mL 37ºC 预热的不含抗菌素液体培养基后，37ºC 保温1小时。
如能160~225rpm 振荡培养更佳。

• 将 50-100 μL 菌液涂布在含适当抗菌素的琼脂平板培养基上，37ºC过夜培养。