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BTN100601 细胞核微量制备试剂盒
发布时间：2017-10-01 10:30 | 点击次数：320
细胞核微量制备试剂盒说明书
产品编号：BTN100601
规格：50T
产品及特点：
用高密度介质来分离动物软体组织（如肝脏、脾脏等）细胞核是目前主流的方法，它是由Chauveau 于1956 年发明，其原理是细胞核的密度较大，在高速离心条件下（40 000g 1小时）可在高密度介质（2.2mol/l 蔗糖溶液）中沉降下来，从而达到与细胞质其它成分分开的目的。该方法能通过一步离心得到较高纯度的细胞核，得到广泛应用。本产品就是在Chauveau 方法的基础上优化改进而来，它具有下列特点：
3. 精心调节了介质的pH，防止细胞核在分离过程中的聚集，还能保持细胞核的精细结构。
4. 快速，整个操作过程仅需1小时即可完成（对一个样品而言）。
5. 提供染色试剂，可以在普通光学显微镜下检测纯化的细胞核的纯度。
6. 处理温和，得到的细胞核中的大部分蛋白质都具有活性，可以用于胶迟阻实验、酶活性分析细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究；也可用于超大片段DNA 的纯化。
7. 不但适用于动物和植物培养细胞，还能用于实体组织（能用Dounce 或Potter 匀浆器匀浆的组织均可）。
8. 一次微量提取足够处理0.1 克组织或10E7 个培养细胞，本产品足够50次微量提取。
规格及成分：
保存条件：
常温运输和保存，有效期一年。
自备试剂：
手动或电动Dounce 或Potter 组织匀浆器（研磨杵和套管的空隙最好为0.1mm，如果小于细胞核的直径，则会使细胞核破裂）、水平式低温高速离心机、光学显微镜。
使用方法：
一、准备工作：先将溶液A 的成分二（干粉）全部加入到溶液A 成分一（溶液）中，摇晃溶解后得到100mL 溶液A。将溶液B 的成分二（干粉）全部加入到溶液B 成分一（溶液）中，摇晃溶解后得到50mL 溶液B。4℃放置不能超过2 天，长期放置需要放-20℃。
二、微量细胞核分离（放量提取各试剂的用量可以按比例放大）：
1. 对组织细胞：称取100～200 mg 新鲜组织（如动物肝脏、脑、心肌和植物叶片等），用自备的PBS 或生理盐水洗净血水，滤纸吸干，用剪刀或刀片将其剪为碎块（最好大小为1cm3，过小反而不利于匀浆）放入小容量Dounce 或Potter 玻璃匀浆器内。
2. 对培养细胞：用自备胰酶按标准方法消化培养细胞，PBS 洗涤，800×g 5～10 分钟离心收集细胞，计数。每次微量提取需要5×10E7个细胞，加入1.0 mL 预冷的溶液A 重悬细胞，然后转移到小容量Dounce 或Potter 玻璃匀浆器内
3. 用Dounce 或Potter 组织匀浆器在冰上破碎组织或细胞。如果用手动匀浆器，一般需要20～30 次。如果用电动匀浆器，一般需要处理3-5 次，每次5～10 秒钟（转速为500r/min）。
4. 将匀浆液转移到离心管中。如果匀浆液有可见的结缔组织和未破碎的组织块，可以用三层自备的纱布放在1.5 mL 离心管管口，将匀浆液过滤进入离心管。可取少量滤液涂在载玻片上制得涂片A，自然干燥涂片以便染色做显微镜观察。
5. 4℃，700-800×g 水平离心5-10 分钟。细胞核沉淀在收集管底部，弃上清。可取少量上清液涂在载玻片上制得涂片B，自然干燥涂片以便染色做显微镜观察。
6. 加入0.5 mL 预冷溶液A 重悬沉淀。用预冷的匀浆器（用前需要将表面的组织洗去）重悬沉淀。可取少量上清液涂在载玻片上制得涂片C，自然干燥涂片以便染色做显微镜观察。
7. 在水平型离心管中加入0.5mL 预冷的溶液B，然后靠管壁慢慢加入上步得到的重悬液。
8. 在4℃ 23000g 离心30 分钟，管底的沉淀即为细胞核。
9. 小心吸弃上清液。注意：上清一般比较粘稠，最好倒立一段时间。
10. 用0.5 mL 溶液A 重悬沉淀。
11. 在4℃ 1500g 离心5 分钟，吸弃上清，沉淀即为纯净的细胞核。可以直接使用，也可以加等体积的自备甘油，混匀后放液氮或-70℃保存。可取少量上悬浮液涂在载玻片上制得涂片D，自然干燥涂片以便染色做显微镜观察。
12. 用本方法一般可以从0.1g 肝脏组织中纯化到1-2×107 个细胞核。如果后续试验是Western Blot 和2D-胶电泳，可直接加入上样缓冲液裂解细胞核后上样。
三、显微镜检测涂片，计算效率
1. 将干燥后的A-D 四张涂片加入固定液固定15 分钟，晾干。
2. Giemsa 染液染10 分钟。
3. 自备蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水。
4. 用显微镜（40×）检查涂片，细胞核将呈紫红色，混杂的细胞质为浅蓝色碎片。根据每步细胞核的数量可以粗略估计回收效率。
疑难解答：
本说明书强烈建议用离心力g 而不是转速计算所需的离心速度，因为不同的离心机转子直径不同，即使是同一转速，其离心力也不同。如果只知道转速，可用下式计算离心力。
G＝1.11×(10-5)×R×[rpm]２
G 为离心力，一般以g（重力加速度）的倍数来表示；[rpm]２即转速的平方；
R 为离心机转子的半径（单位为厘米）。
产品编号：BTN100601
规格：50T
产品及特点：
用高密度介质来分离动物软体组织（如肝脏、脾脏等）细胞核是目前主流的方法，它是由Chauveau 于1956 年发明，其原理是细胞核的密度较大，在高速离心条件下（40 000g 1小时）可在高密度介质（2.2mol/l 蔗糖溶液）中沉降下来，从而达到与细胞质其它成分分开的目的。该方法能通过一步离心得到较高纯度的细胞核，得到广泛应用。本产品就是在Chauveau 方法的基础上优化改进而来，它具有下列特点：
- 基于密度梯度分离，可有效去除细胞质及其他细胞器，得到的细胞核纯净。
3. 精心调节了介质的pH，防止细胞核在分离过程中的聚集，还能保持细胞核的精细结构。
4. 快速，整个操作过程仅需1小时即可完成（对一个样品而言）。
5. 提供染色试剂，可以在普通光学显微镜下检测纯化的细胞核的纯度。
6. 处理温和，得到的细胞核中的大部分蛋白质都具有活性，可以用于胶迟阻实验、酶活性分析细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究；也可用于超大片段DNA 的纯化。
7. 不但适用于动物和植物培养细胞，还能用于实体组织（能用Dounce 或Potter 匀浆器匀浆的组织均可）。
8. 一次微量提取足够处理0.1 克组织或10E7 个培养细胞，本产品足够50次微量提取。
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| 溶液A 成分一 | 100ml |
| 溶液A 成分二（干粉） | 约20g |
| 溶液B 成分一 | 50ml |
| 溶液B 成分二（干粉） | 约100g |
| 细胞核染色液 | 1套 |
| 说明书 | 1份 |
常温运输和保存，有效期一年。
自备试剂：
手动或电动Dounce 或Potter 组织匀浆器（研磨杵和套管的空隙最好为0.1mm，如果小于细胞核的直径，则会使细胞核破裂）、水平式低温高速离心机、光学显微镜。
使用方法：
一、准备工作：先将溶液A 的成分二（干粉）全部加入到溶液A 成分一（溶液）中，摇晃溶解后得到100mL 溶液A。将溶液B 的成分二（干粉）全部加入到溶液B 成分一（溶液）中，摇晃溶解后得到50mL 溶液B。4℃放置不能超过2 天，长期放置需要放-20℃。
二、微量细胞核分离（放量提取各试剂的用量可以按比例放大）：
1. 对组织细胞：称取100～200 mg 新鲜组织（如动物肝脏、脑、心肌和植物叶片等），用自备的PBS 或生理盐水洗净血水，滤纸吸干，用剪刀或刀片将其剪为碎块（最好大小为1cm3，过小反而不利于匀浆）放入小容量Dounce 或Potter 玻璃匀浆器内。
2. 对培养细胞：用自备胰酶按标准方法消化培养细胞，PBS 洗涤，800×g 5～10 分钟离心收集细胞，计数。每次微量提取需要5×10E7个细胞，加入1.0 mL 预冷的溶液A 重悬细胞，然后转移到小容量Dounce 或Potter 玻璃匀浆器内
3. 用Dounce 或Potter 组织匀浆器在冰上破碎组织或细胞。如果用手动匀浆器，一般需要20～30 次。如果用电动匀浆器，一般需要处理3-5 次，每次5～10 秒钟（转速为500r/min）。
4. 将匀浆液转移到离心管中。如果匀浆液有可见的结缔组织和未破碎的组织块，可以用三层自备的纱布放在1.5 mL 离心管管口，将匀浆液过滤进入离心管。可取少量滤液涂在载玻片上制得涂片A，自然干燥涂片以便染色做显微镜观察。
5. 4℃，700-800×g 水平离心5-10 分钟。细胞核沉淀在收集管底部，弃上清。可取少量上清液涂在载玻片上制得涂片B，自然干燥涂片以便染色做显微镜观察。
6. 加入0.5 mL 预冷溶液A 重悬沉淀。用预冷的匀浆器（用前需要将表面的组织洗去）重悬沉淀。可取少量上清液涂在载玻片上制得涂片C，自然干燥涂片以便染色做显微镜观察。
7. 在水平型离心管中加入0.5mL 预冷的溶液B，然后靠管壁慢慢加入上步得到的重悬液。
8. 在4℃ 23000g 离心30 分钟，管底的沉淀即为细胞核。
9. 小心吸弃上清液。注意：上清一般比较粘稠，最好倒立一段时间。
10. 用0.5 mL 溶液A 重悬沉淀。
11. 在4℃ 1500g 离心5 分钟，吸弃上清，沉淀即为纯净的细胞核。可以直接使用，也可以加等体积的自备甘油，混匀后放液氮或-70℃保存。可取少量上悬浮液涂在载玻片上制得涂片D，自然干燥涂片以便染色做显微镜观察。
12. 用本方法一般可以从0.1g 肝脏组织中纯化到1-2×107 个细胞核。如果后续试验是Western Blot 和2D-胶电泳，可直接加入上样缓冲液裂解细胞核后上样。
三、显微镜检测涂片，计算效率
1. 将干燥后的A-D 四张涂片加入固定液固定15 分钟，晾干。
2. Giemsa 染液染10 分钟。
3. 自备蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水。
4. 用显微镜（40×）检查涂片，细胞核将呈紫红色，混杂的细胞质为浅蓝色碎片。根据每步细胞核的数量可以粗略估计回收效率。
疑难解答：
本说明书强烈建议用离心力g 而不是转速计算所需的离心速度，因为不同的离心机转子直径不同，即使是同一转速，其离心力也不同。如果只知道转速，可用下式计算离心力。
G＝1.11×(10-5)×R×[rpm]２
G 为离心力，一般以g（重力加速度）的倍数来表示；[rpm]２即转速的平方；
R 为离心机转子的半径（单位为厘米）。