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BTN100811 质谱兼容型蛋白银染试剂盒
发布时间：2017-10-01 10:36 | 点击次数：418
质谱兼容型蛋白银染试剂盒说明书
产品编号：BTN100811
规格：10T
产品及特点：
银染是目前检测PAGE 电泳分离后的蛋白质的最灵敏的方法，MS（质谱）是确定未知蛋白最常用和最快捷的方法，但将银染得到的蛋白直接用于MS 分析有很多问题，其中最主要问题是常规银染所使用的试剂（包括强氧化剂和醛类）容易使蛋白质发生化学修饰，这样MS分析得到的氨基酸信息跟蛋白质实际的氨基酸信息并不相同。为了使银染得到的蛋白质可以用于MS分析，为此本公司开发MS 兼容型银染试剂盒，其特点如下：
1. 跟MS 兼容，原理是避免使用能化学修饰蛋白质的试剂，所得蛋白质没有发生化学修饰，故可直接用于后续的MS（包括MALDI-TOF-MS 和ESI-MS）分析。
2. 银染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高100倍左右，可达0.2-0.6ng蛋白质/条带。
3. 可用于各种PAGE 胶，包括变性PAGE 胶（如SDS-PAGE，尿素-PAGE），非变性PAGE 胶，IEF 胶（等电电泳胶），2D 胶等。
4. 四种溶液都是现用现配，实验结果的可重复性好。
规格及成分：
保存条件：
常温运输及保存，有效期一年。
自备试剂：
去离子水（最好MilliQ 级别，电导在5MW以上），甲醇和乙酸。
使用方法：
准备工作
所有溶液均需现配现用。以下按一块PAGE 胶需要200 mL 溶液配制，用户可以根据自己PAGE 胶的大小增减溶液的用量。
一：用自备试剂配制400mL固定液（按一次银染需要固定2 次计算，每次固定需200mL固定液）
将160mL甲醇、40mL乙酸和200 mL去离子水充分混合后即得400mL固定液。
二：配制200 mL 溶液A
先配制溶液A 组分一储备液：将溶液A 组分一干粉加入到100 mL 溶液A 组分一溶剂中，充分摇晃溶解即得溶液A 组分一储备液。此溶液可以4℃保存。将60 mL 甲醇、8 mL 溶液A 组分一储备液、1 份溶液A 组分二（干粉）和132 mL 去离子水充分混合后即得200 mL 溶液A。
三：配制200 mL 溶液B
称0.5g 溶液B 干粉，溶于200 mL 去离子水中，充分混合后即得200 mL 溶液B。
四：配制200 mL 溶液C
将1 份溶液C（干粉）溶解在200 mL 去离子水中（干粉不容易溶解，需搅拌）即得溶液C。注意：使用前还需要再加入160 uL 溶液C 组分二并充分混匀。
五：配制200 mL 溶液D
将1 份溶液D（干粉）溶解在200 mL 去离子水中即得溶液D。
银染
1. PAGE 电泳（包括非变性PAGE，SDS-PAGE，尿素-PAGE，2D-PAGE，IEF-PAGE 等）结束后，将PAGE 胶转移到装有200 mL 固定液的瓷盘或玻璃盘中，摇晃30 分钟以去除干扰银染的组分（如甘氨酸、SDS、尿素、DTT、甘油等），倒掉固定液。注：此步很重要，否则银染背景很高。
2. 重复上步一次。
3. 将PAGE 胶转移到200mL 溶液A中，室温摇晃30分钟。
4. 用200 mL 去离子水漂洗3次，每次5分钟（不要延长或缩短）。
5. 将PAGE 胶转移到200 mL的溶液B中，室温摇晃20 分钟。
6. 用200 mL 去离子水漂洗2 次，每次1分钟（不要延长或缩短）。
7. 将PAGE 胶转移到200 mL的溶液C中，室温摇晃直到蛋白电泳条带显现（一般需要10 分钟左右）。
8. 将PAGE 胶转移到200 mL的溶液D中，室温摇晃终止反应。
9. 用200 mL 去离子水漂洗3次，每次5分钟（不要延长或缩短）。
10. 切下条带或胶块进行后续的脱银，原位trypsin 酶解，多肽沉淀和MS 分析（略）。
技术资料：
MS前处理步骤（仅供参考）
1. 脱银：将切下的银染斑点或条带用脱银液（30 mM K3Fe（CN）3 和100 mM Na2S2O3的1：1的混合液）处理直到黑色消失。
2. 还原：将胶块或胶条置于10 mM DTT（溶剂为50 mM NH4HCO3），56℃处理一小时。
3. 烷化：将胶块或胶条置于55 mM 碘乙酰胺（溶剂为50 mM NH4HCO3），室温避光处理45 分钟。
4. 原位trypsin 酶解：将胶块或胶条置于10 ng/uL 测序级别的trypsin 溶液中（溶剂为25 mM NH4HCO3），37℃处理过夜。
5. 多肽提取：用5%三氟乙酸抽提酶解液，再用2.5%三氟乙酸-50%ACN 混合液抽提酶解液，上清真空干燥，沉淀（多肽）最后溶于0.5%三氟乙酸中。
6. MS 分析：参考相关MS 仪器使用手册。
产品编号：BTN100811
规格：10T
产品及特点：
银染是目前检测PAGE 电泳分离后的蛋白质的最灵敏的方法，MS（质谱）是确定未知蛋白最常用和最快捷的方法，但将银染得到的蛋白直接用于MS 分析有很多问题，其中最主要问题是常规银染所使用的试剂（包括强氧化剂和醛类）容易使蛋白质发生化学修饰，这样MS分析得到的氨基酸信息跟蛋白质实际的氨基酸信息并不相同。为了使银染得到的蛋白质可以用于MS分析，为此本公司开发MS 兼容型银染试剂盒，其特点如下：
1. 跟MS 兼容，原理是避免使用能化学修饰蛋白质的试剂，所得蛋白质没有发生化学修饰，故可直接用于后续的MS（包括MALDI-TOF-MS 和ESI-MS）分析。
2. 银染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高100倍左右，可达0.2-0.6ng蛋白质/条带。
3. 可用于各种PAGE 胶，包括变性PAGE 胶（如SDS-PAGE，尿素-PAGE），非变性PAGE 胶，IEF 胶（等电电泳胶），2D 胶等。
4. 四种溶液都是现用现配，实验结果的可重复性好。
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| 溶液A 组分一干粉 | 1份 |
| 溶液A 组分一溶剂 | 100ml |
| 溶液A 组分二干粉 | 10份 |
| 溶液B 干粉 | 5g |
| 溶液C 组分一干粉 | 10份 |
| 溶液C 组分二 | 2ml |
| 溶液D 干粉 | 10份 |
| 说明书 | 1份 |
常温运输及保存，有效期一年。
自备试剂：
去离子水（最好MilliQ 级别，电导在5MW以上），甲醇和乙酸。
使用方法：
准备工作
所有溶液均需现配现用。以下按一块PAGE 胶需要200 mL 溶液配制，用户可以根据自己PAGE 胶的大小增减溶液的用量。
一：用自备试剂配制400mL固定液（按一次银染需要固定2 次计算，每次固定需200mL固定液）
将160mL甲醇、40mL乙酸和200 mL去离子水充分混合后即得400mL固定液。
二：配制200 mL 溶液A
先配制溶液A 组分一储备液：将溶液A 组分一干粉加入到100 mL 溶液A 组分一溶剂中，充分摇晃溶解即得溶液A 组分一储备液。此溶液可以4℃保存。将60 mL 甲醇、8 mL 溶液A 组分一储备液、1 份溶液A 组分二（干粉）和132 mL 去离子水充分混合后即得200 mL 溶液A。
三：配制200 mL 溶液B
称0.5g 溶液B 干粉，溶于200 mL 去离子水中，充分混合后即得200 mL 溶液B。
四：配制200 mL 溶液C
将1 份溶液C（干粉）溶解在200 mL 去离子水中（干粉不容易溶解，需搅拌）即得溶液C。注意：使用前还需要再加入160 uL 溶液C 组分二并充分混匀。
五：配制200 mL 溶液D
将1 份溶液D（干粉）溶解在200 mL 去离子水中即得溶液D。
银染
1. PAGE 电泳（包括非变性PAGE，SDS-PAGE，尿素-PAGE，2D-PAGE，IEF-PAGE 等）结束后，将PAGE 胶转移到装有200 mL 固定液的瓷盘或玻璃盘中，摇晃30 分钟以去除干扰银染的组分（如甘氨酸、SDS、尿素、DTT、甘油等），倒掉固定液。注：此步很重要，否则银染背景很高。
2. 重复上步一次。
3. 将PAGE 胶转移到200mL 溶液A中，室温摇晃30分钟。
4. 用200 mL 去离子水漂洗3次，每次5分钟（不要延长或缩短）。
5. 将PAGE 胶转移到200 mL的溶液B中，室温摇晃20 分钟。
6. 用200 mL 去离子水漂洗2 次，每次1分钟（不要延长或缩短）。
7. 将PAGE 胶转移到200 mL的溶液C中，室温摇晃直到蛋白电泳条带显现（一般需要10 分钟左右）。
8. 将PAGE 胶转移到200 mL的溶液D中，室温摇晃终止反应。
9. 用200 mL 去离子水漂洗3次，每次5分钟（不要延长或缩短）。
10. 切下条带或胶块进行后续的脱银，原位trypsin 酶解，多肽沉淀和MS 分析（略）。
技术资料：
MS前处理步骤（仅供参考）
1. 脱银：将切下的银染斑点或条带用脱银液（30 mM K3Fe（CN）3 和100 mM Na2S2O3的1：1的混合液）处理直到黑色消失。
2. 还原：将胶块或胶条置于10 mM DTT（溶剂为50 mM NH4HCO3），56℃处理一小时。
3. 烷化：将胶块或胶条置于55 mM 碘乙酰胺（溶剂为50 mM NH4HCO3），室温避光处理45 分钟。
4. 原位trypsin 酶解：将胶块或胶条置于10 ng/uL 测序级别的trypsin 溶液中（溶剂为25 mM NH4HCO3），37℃处理过夜。
5. 多肽提取：用5%三氟乙酸抽提酶解液，再用2.5%三氟乙酸-50%ACN 混合液抽提酶解液，上清真空干燥，沉淀（多肽）最后溶于0.5%三氟乙酸中。
6. MS 分析：参考相关MS 仪器使用手册。