产品分类
公司新闻
BTN100903 AFLP试剂盒（EcoRI-MseI）
发布时间：2017-10-01 10:41 | 点击次数：182
AFLP试剂盒（EcoRI-MseI）说明书
产品编号：BTN100903
规格：1600T
产品及特点：
AFLP（amplified fragment length polymorphism）原理是一种结合RFLP 和PCR 技术特点的、迄今为止最有效分子标记分型技术，其原理如下：
本产品在传统AFLP-PCR 的基础上经过精心优化而开发，它具有下列特点：
1. 一站式，足够50 次酶切-连接反应、50 次预扩反应和1600 次AFLP PCR（PCR按30 μL 体系计算），但不包括DNA 纯化和带型分析试剂（如PAGE 电泳试剂和银染试剂）。
2. 本系列产品提供EcoRI-MseI 组合，适用于GC 含量在50%以上的基因组。对GC 含量在50%以下的基因组，需从本公司采购AFLP（EcoRI-TaqI）组合。
3. 各种参数都经过优化，一次PCR 所得AFLP 片段数一般在10-100 之间，可重复性好，误差小于0.6%。
4. 本产品适用于基因组在500 Mb-6000 Mb 的材料（如动物和植物），对于基因组在50-500 Mb 的材料（如细菌和真菌）或50Mb 以下的材料（如质粒，cosmid，BAC，YAC 和PAC 等），需要分别另购专门的+1 型预扩引物混合液和+3 型EcoRI引物（8 种）AFLP 引物对。
规格及成分：
+2 型EcoRI 引物和+3 型MseI 引物最后碱基的序列
保存条件：
低温运输、-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂：
Southern 级DNA 纯化试剂，尿素-PAGE 电泳套装，银染试剂盒。
使用方法：
一、 DNA 提取（本试剂盒不提供相关试剂）
用户需要自备50-500ng Southern 级别的基因组DNA，用前最好预实验以确保DNA能够被EcoRI 和MseI 内切酶彻底切开。
二、 限制性酶切和接头连接反应（本试剂盒足够50 次本反应）
1. 在0.2 mL 离心管中加入设置20 μL 的限制性内切酶酶切体系：
2. 轻柔混匀并短暂离心后，37℃保温2 小时酶切（若PCR 仪器不带热盖，则必须加50μL自备石蜡油，否则水分会蒸发影响反应。下同），70℃保温15 分钟灭活内切酶。
3. 在上述酶反应体系中加入20 μL EcoRI-MseI 接头混合物和1 μL T4 DNA 连接酶，轻柔混匀并短暂离心后，20℃保温2 小时让接头跟DNA 片段相连。
4. 在一个离心管中加入10 μL 上步得到的连接反应液和90μL TE 缓冲液，pH8，充分混匀，得到酶切-连接反应10 倍稀释液，未用完的酶切-连接反应原液（30μL）可放-20℃保存。
三、 预扩增（本试剂盒足够50 次本反应）
5. 在0.2 mL 离心管中设置30 μL 的PCR 体系：
7. 可以取10 μL PCR 产物在1.5%琼脂糖胶上电泳检测，产物为100-1500 bp 模糊条带。
8. 将剩下的预扩反应液用TE 稀释50 倍，直接用于下步反应或放-20℃保存待用。
四、选择性PCR 扩增(本试剂盒足够至少1600 次本反应)
9. 在0.2 mL PCR 管中，加入下列成分（如果用户已经知道哪个一种或几种引物组合适合自己的材料，则直接使用；如果不知道，则需要预先测试所有64 种组合，设置64 个PCR反应），下面只是一种组合：
五、尿素-PAGE 电泳和银染（需另购试剂并按相关说明书进行）
产品编号：BTN100903
规格：1600T
产品及特点：
AFLP（amplified fragment length polymorphism）原理是一种结合RFLP 和PCR 技术特点的、迄今为止最有效分子标记分型技术，其原理如下：
本产品在传统AFLP-PCR 的基础上经过精心优化而开发，它具有下列特点：
1. 一站式，足够50 次酶切-连接反应、50 次预扩反应和1600 次AFLP PCR（PCR按30 μL 体系计算），但不包括DNA 纯化和带型分析试剂（如PAGE 电泳试剂和银染试剂）。
2. 本系列产品提供EcoRI-MseI 组合，适用于GC 含量在50%以上的基因组。对GC 含量在50%以下的基因组，需从本公司采购AFLP（EcoRI-TaqI）组合。
3. 各种参数都经过优化，一次PCR 所得AFLP 片段数一般在10-100 之间，可重复性好，误差小于0.6%。
4. 本产品适用于基因组在500 Mb-6000 Mb 的材料（如动物和植物），对于基因组在50-500 Mb 的材料（如细菌和真菌）或50Mb 以下的材料（如质粒，cosmid，BAC，YAC 和PAC 等），需要分别另购专门的+1 型预扩引物混合液和+3 型EcoRI引物（8 种）AFLP 引物对。
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| 酶切-连接Buffer，10× | 100μl |
| EcoRI-MseI 酶混合液 | 100μl |
| EcoRI-MseI 接头混合物 | 1ml |
| T4 DNA 连接酶（1U/μL） | 50μl |
| +0 型预扩引物混合液 | 750μl |
| PCR Mix 3.0 | 9ml×3 |
| 对照DNA（50ng/μL） | 20μl |
| +2 型EcoRI 引物（8 条） | 1ml每种 |
| +3 型MseI 引物（8 条） | 1ml每种 |
| TE 溶液，pH8.0 | 10ml |
| 超纯水 | 10ml |
| 说明书 | 1份 |
| 引物名称 | 8 条引物3’最后碱基 |
| +2 型EcoRI引物 | -AA、-AT、-AG、-AC、-TA、-TT、-TG、-TC |
| +3 型 MseI引物 | -CAA、-CAC、-CAG、-CAT、-CTA、-CTC、-CTG、-CTT |
低温运输、-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂：
Southern 级DNA 纯化试剂，尿素-PAGE 电泳套装，银染试剂盒。
使用方法：
一、 DNA 提取（本试剂盒不提供相关试剂）
用户需要自备50-500ng Southern 级别的基因组DNA，用前最好预实验以确保DNA能够被EcoRI 和MseI 内切酶彻底切开。
二、 限制性酶切和接头连接反应（本试剂盒足够50 次本反应）
1. 在0.2 mL 离心管中加入设置20 μL 的限制性内切酶酶切体系：
| 成分 | 用量 |
| 酶切-连接Buffer，10× | 2μl |
| 样品DNA | 50 ng（对小基因组材料） 500 ng（对大基因组材料） 如果用对照，则用5μL |
| EcoR I-Mse I 酶混合液 | 2μl |
| 超纯水 | 加水到20μl |
3. 在上述酶反应体系中加入20 μL EcoRI-MseI 接头混合物和1 μL T4 DNA 连接酶，轻柔混匀并短暂离心后，20℃保温2 小时让接头跟DNA 片段相连。
4. 在一个离心管中加入10 μL 上步得到的连接反应液和90μL TE 缓冲液，pH8，充分混匀，得到酶切-连接反应10 倍稀释液，未用完的酶切-连接反应原液（30μL）可放-20℃保存。
三、 预扩增（本试剂盒足够50 次本反应）
5. 在0.2 mL 离心管中设置30 μL 的PCR 体系：
| 成分 | 体积 |
| 酶切-连接反应液10 倍稀释液 | 5μl |
| +0 型预扩引物混合液 | 10μl |
| PCR Mix 3.0 | 15μl |
- 离心数秒，按下列参数进行PCR 预扩增：
| 温度 | 时间 | |
| PCR（20 次） | 94℃ | 30s |
| 56℃ | 60s | |
| 72℃ | 60s |
8. 将剩下的预扩反应液用TE 稀释50 倍，直接用于下步反应或放-20℃保存待用。
四、选择性PCR 扩增(本试剂盒足够至少1600 次本反应)
9. 在0.2 mL PCR 管中，加入下列成分（如果用户已经知道哪个一种或几种引物组合适合自己的材料，则直接使用；如果不知道，则需要预先测试所有64 种组合，设置64 个PCR反应），下面只是一种组合：
| 成分 | 体积 |
| 预扩反应液50 倍稀释液 | 5μl |
| +2 型EcoR I 引物之一（八种之一） | 5μl |
| +3 型Mse I 引物之一（八种之一） | 5μl |
| PCR Mix 3.0 | 15μl |
- 轻柔混匀后离心数秒，按下列参数进行PCR：
| 温度 | 时间 | |
| PCR（13 次） | 94℃ | 30s |
| 65℃ | 30s（每次循环递减0.7℃） | |
| 72℃ | 60s | |
| PCR（13 次） | 94℃ | 30s |
| 55℃ | 30s | |
| 72℃ | 60s | |
| 延伸 | 72℃ | 5min |