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BTN100923 甲基化专一性PCR试剂盒
发布时间：2017-10-01 10:53 | 点击次数：310
甲基化专一性PCR试剂盒说明书
产品编号：BTN100923
规格：50T
产品及特点：
本产品是基于PCR的甲基化DNA检测试剂盒（即MSP试剂盒）。它由两个成分组成，一个是亚硫酸氢盐试剂盒，用于将DNA中所有没有甲基化的C转化成U，而甲基化的C不变。二是优化的PCR试剂盒，利用客户自备的专一性引物，根据PCR来检测甲基化位点的位置。本产品的特点如下:
1． 本产品是亚硫酸盐修饰试剂盒和即用型PCR 3.0的整合，即开即用，非常方便。
2． 柱式DNA回收方法极大提高亚硫酸盐修饰后DNA的回收率。
3． 优化的PCR mix，含有PCR所需要的所有成分，减少了操作误差。
4． PCR结束后可以直接上样电泳，非常方便。
5． 用户需要自备MSP专一性引物。
规格及成分：
保存条件：
常温运输和保存（PCR MagicMix 3.0要低温运输，-20℃保存），有效期一年。
自备试剂：
超纯水、MSP引物、对照DNA模板和引物。
注：严格的实验一般要求下列5种对照DNA模板和相应的引物对，用户可以根据自身实验的要求只做其中的部分。
使用方法：
（一）亚硫酸氢盐修饰
一：准备试剂
1. 配制溶液B成分一溶液：加5.0 mL 超纯水和27 μL溶液A到装有溶液B成分一干粉的棕色塑料瓶中，轻柔摇晃至溶（尽量少的剧烈摇晃，约需要5分钟），总体积约5.5 mL。
2. 配制溶液B成分二溶液：加10mL超纯水到装有溶液B成分二干粉的棕色塑料瓶中，轻柔摇晃混匀（尽量少的剧烈摇晃）。
3. 配制溶液B工作液：将55μL溶液B成分二溶液加入到溶液B成分一溶液中，轻柔颠倒混匀即可使用。一瓶溶液B工作液可以用10次。
二：DNA变性处理
1. 将5μL溶液A加入到45μL DNA溶液中并吹打混匀（总体积没有45μL需要用水补足到45μL，DNA总量在0.2-5 μg之间，不能超过 5 μg，一般使用2 μg DNA即可）。 注意：DNA必须是线状的，长度最好在20-50 Kb左右。基因组DNA可以预先用酶切处理（酶的位点不得在研究的DNA序列之内），也可以用机械打断法处理（得到的DNA一般在20-50 Kb左右）。
2. 37℃放置15分钟使DNA充分变性。
3. 立即在DNA溶液中加入500 μL溶液B工作液，轻柔颠倒混匀。
4. 55℃避光保温8-16小时。如果使用水浴或没有热盖的PCR仪器保温，最好加50-100μL石蜡油，避免水分蒸发。
注意：必须避光保温。55℃处理8小时足以使95%的C变成U，保温时间过长会引起DNA的断裂。如果有的区域的C难以转化成U，可以改用两步式PCR处理（每55℃保温3小时后95℃变性处理5分钟，共5-10个循环），效果会更佳。
5. 冰浴10分钟。
6. 加入1 mL的通用溶胶液，颠倒混匀后取一半溶液上柱。单链DNA会结合在离心吸附柱上，亚硫酸氢盐等将穿透过柱。
7. 12,000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。
8. 取另一半溶液再上柱，12,000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。单链DNA会结合在离心吸附柱上，亚硫酸氢盐等将穿透过柱。
9. 加入0.7 mL通用洗柱液，12,000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。此步可以洗涤残留的亚硫酸氢盐。
10. 干甩半分钟后，将离心吸附柱转移到一个新的离心管中，加入50 μL新鲜配制的溶液A稀释液（5 μL的溶液A原液与45 μL的超纯水混合而得），室温放置2分钟后离心半分钟。
11. 将洗脱下来的DNA溶液放置在37℃保温15分钟。
12. 加入0.7 mL的通用溶胶液，混匀后上柱。
13.12,000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。单链DNA会结合在离心吸附柱上，杂质等将穿透过柱。
14. 干甩半分钟后，将离心吸附柱转移到一个新的离心管中，加入50 μL DNA洗脱液，室温放置2分钟后离心半分钟。
15. 所得溶液即为亚硫酸氢盐修饰的DNA，可以用于下面的甲基化专一PCR。
说明：此方法的回收率一般为50%，2μg DNA最后可以得到1 μg的修饰后的DNA。由于修饰后的DNA呈长短不一的单链，EB染色效果很差，所以不能用灵敏度低的琼脂糖电泳-EB染色的方法检测，但可以用灵敏度更高的PAGE-银染方法检测。
（二）甲基化专一性PCR（以60 μL的标准PCR反应体系为例）
1. 在一干净的PCR管中，加入下列成分（冰上操作）：
注：有5种对照DNA模板可以供用户根据自身需要选择，详见自备试剂栏。
2. 将混合物混匀，放入PCR仪中进行热启动PCR，结束后取5-10μL PCR产品直接进行琼脂糖电泳。
产品编号：BTN100923
规格：50T
产品及特点：
本产品是基于PCR的甲基化DNA检测试剂盒（即MSP试剂盒）。它由两个成分组成，一个是亚硫酸氢盐试剂盒，用于将DNA中所有没有甲基化的C转化成U，而甲基化的C不变。二是优化的PCR试剂盒，利用客户自备的专一性引物，根据PCR来检测甲基化位点的位置。本产品的特点如下:
1． 本产品是亚硫酸盐修饰试剂盒和即用型PCR 3.0的整合，即开即用，非常方便。
2． 柱式DNA回收方法极大提高亚硫酸盐修饰后DNA的回收率。
3． 优化的PCR mix，含有PCR所需要的所有成分，减少了操作误差。
4． PCR结束后可以直接上样电泳，非常方便。
5． 用户需要自备MSP专一性引物。
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| 溶液A | 5ml |
| 溶液B成分一（干粉） | 2.3g×5瓶 |
| 溶液B成分二（干粉） | 110mg×5瓶 |
| 通用溶胶液 | 50mL×2 |
| 离心吸附柱 | 50套×2 |
| 通用洗柱液 | 100mL |
| DNA洗脱液 | 10mL |
| PCR MagicMix 3.0 | 1.5mL |
| 说明书 | 1份 |
常温运输和保存（PCR MagicMix 3.0要低温运输，-20℃保存），有效期一年。
自备试剂：
超纯水、MSP引物、对照DNA模板和引物。
注：严格的实验一般要求下列5种对照DNA模板和相应的引物对，用户可以根据自身实验的要求只做其中的部分。
| 对照名称 | 起始DNA | 处理 |
| 未修饰未甲基化DNA对照 | 未甲基化DNA（无甲基化宿主菌或体外扩增而得） | 未经过亚硫酸氢盐修饰 |
| 已修饰未甲基化DNA对照 | 未甲基化DNA（同上） | 经过亚硫酸氢盐修饰 |
| 未修饰甲基化DNA对照 | 甲基化DNA（用甲基化酶修饰未甲基化DNA而得） | 未经过亚硫酸氢盐修饰 |
| 已修饰甲基化DNA对照 | 甲基化DNA（同上） | 经过亚硫酸氢盐修饰 |
| 未修饰样品DNA对照 | 样品DNA | 未经过亚硫酸氢盐修饰 |
（一）亚硫酸氢盐修饰
一：准备试剂
1. 配制溶液B成分一溶液：加5.0 mL 超纯水和27 μL溶液A到装有溶液B成分一干粉的棕色塑料瓶中，轻柔摇晃至溶（尽量少的剧烈摇晃，约需要5分钟），总体积约5.5 mL。
2. 配制溶液B成分二溶液：加10mL超纯水到装有溶液B成分二干粉的棕色塑料瓶中，轻柔摇晃混匀（尽量少的剧烈摇晃）。
3. 配制溶液B工作液：将55μL溶液B成分二溶液加入到溶液B成分一溶液中，轻柔颠倒混匀即可使用。一瓶溶液B工作液可以用10次。
二：DNA变性处理
1. 将5μL溶液A加入到45μL DNA溶液中并吹打混匀（总体积没有45μL需要用水补足到45μL，DNA总量在0.2-5 μg之间，不能超过 5 μg，一般使用2 μg DNA即可）。 注意：DNA必须是线状的，长度最好在20-50 Kb左右。基因组DNA可以预先用酶切处理（酶的位点不得在研究的DNA序列之内），也可以用机械打断法处理（得到的DNA一般在20-50 Kb左右）。
2. 37℃放置15分钟使DNA充分变性。
3. 立即在DNA溶液中加入500 μL溶液B工作液，轻柔颠倒混匀。
4. 55℃避光保温8-16小时。如果使用水浴或没有热盖的PCR仪器保温，最好加50-100μL石蜡油，避免水分蒸发。
注意：必须避光保温。55℃处理8小时足以使95%的C变成U，保温时间过长会引起DNA的断裂。如果有的区域的C难以转化成U，可以改用两步式PCR处理（每55℃保温3小时后95℃变性处理5分钟，共5-10个循环），效果会更佳。
5. 冰浴10分钟。
6. 加入1 mL的通用溶胶液，颠倒混匀后取一半溶液上柱。单链DNA会结合在离心吸附柱上，亚硫酸氢盐等将穿透过柱。
7. 12,000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。
8. 取另一半溶液再上柱，12,000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。单链DNA会结合在离心吸附柱上，亚硫酸氢盐等将穿透过柱。
9. 加入0.7 mL通用洗柱液，12,000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。此步可以洗涤残留的亚硫酸氢盐。
10. 干甩半分钟后，将离心吸附柱转移到一个新的离心管中，加入50 μL新鲜配制的溶液A稀释液（5 μL的溶液A原液与45 μL的超纯水混合而得），室温放置2分钟后离心半分钟。
11. 将洗脱下来的DNA溶液放置在37℃保温15分钟。
12. 加入0.7 mL的通用溶胶液，混匀后上柱。
13.12,000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。单链DNA会结合在离心吸附柱上，杂质等将穿透过柱。
14. 干甩半分钟后，将离心吸附柱转移到一个新的离心管中，加入50 μL DNA洗脱液，室温放置2分钟后离心半分钟。
15. 所得溶液即为亚硫酸氢盐修饰的DNA，可以用于下面的甲基化专一PCR。
说明：此方法的回收率一般为50%，2μg DNA最后可以得到1 μg的修饰后的DNA。由于修饰后的DNA呈长短不一的单链，EB染色效果很差，所以不能用灵敏度低的琼脂糖电泳-EB染色的方法检测，但可以用灵敏度更高的PAGE-银染方法检测。
（二）甲基化专一性PCR（以60 μL的标准PCR反应体系为例）
1. 在一干净的PCR管中，加入下列成分（冰上操作）：
| 成分 | 样品管 | 对照管 |
| PCR MagicMix 3.0 | 30μl | 30μl |
| 亚硫酸氢盐修饰的DNA模板 | 100-500ng | 无 |
| 对照DNA模板 | 无 | 100-500ng |
| 自备MSP引物F | 25pmol | 无 |
| 自备MSP引物R | 25pmol | 无 |
| 对照模板专一性PCR引物F | 无 | 25pmol |
| 对照模板专一性PCR引物R | 无 | 25pmol |
| 补水到 | 60μl | 60μl |
2. 将混合物混匀，放入PCR仪中进行热启动PCR，结束后取5-10μL PCR产品直接进行琼脂糖电泳。