BTN100929 细菌膜蛋白质微量提取试剂盒

细菌膜蛋白质微量提取试剂盒说明书
产品编号：BTN100929
规格：50T
产品及特点：
本试剂盒是基于超速离心的快速提取细菌膜蛋白的试剂盒。其原理是裂解细胞后，通过超速离心分离出细胞膜和附着的蛋白质。跟传统的密度梯度离心法和去污剂法相比，本方法具有下列特点：
1. 一步式分离细胞膜和膜蛋白，密度梯度离心法简单快捷。
2. 膜蛋白纯度高，能够去除各种胞浆蛋白的污染，也能去除松散附着在细胞膜上的蛋白，所得膜蛋白主要是整合蛋白。
3. 膜蛋白完整性好，主要是由于实际中有抑制蛋白酶成分。
4. 回收效率高，一般能得到相当于总蛋白量6%的膜蛋白。
5. 可用于E. coli，S. typhimurium，K. aerogens，P. aeruginosa，C.crescentus 等细菌。
规格及成分：

成分	规格
溶液A	125ml
溶液B	25ml
溶液C	250ml
DNase I干粉	3.5mg
说明书	1份

保存条件：
低温运输和保存， DNase I 需要低温保存。有效期一年。
自备试剂：
膜蛋白溶解液（取决于后续实验。如果后续实验为SDS-PAGE，则用1×SDS-PAGE 上样液作为溶解液；如果用于2D 电泳，则使用1×等电点电泳上样液作为溶解液）。
使用方法：
准备：第一次使用本试剂盒时需要将所有DNase I干粉倒入溶液B 中，轻柔颠倒使DNase 干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存，最好在一个月内完，否则DNase 将逐渐失去活性。此外，最好在实验前1 小时将溶液B 冰浴预冷。
用法一：小量制备（主要用于上样量比较小的SDS-PAGE 电泳等实验）
1、收集 20-40 mL 过夜培养的细菌饱和培养液（OD420 在1.5 左右即可），2500g 室温离心10 分钟后弃上清。
2、加入 2 mL 溶液A，轻柔吹打，将细菌重悬于溶液A 中。
3、2500 g 室温离心10 分钟后弃上清。
4、加入 0.5 mL 溶液B（必须已经提前加入了DNase I 干粉），轻柔吹打使细菌重悬。注：如果细菌起始量没有20-40 mL，溶液A 的用量可以等比例降低。重悬在溶液A 中的细菌可以放-80℃长期保存。
5、用超声或French Press 方法裂解细胞。如果用French Press 方法，则需要处理至少两次，每次的压力为9.65×10E7（=14000 psi）。注意：不论用哪种裂解方法，都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解，否则还需要重复细菌裂解过程，直到80%以上的细菌都裂解为止。
6、2500g 室温离心8 分钟后小心转移上清到新的10 mL-15 mL 塑料离心管中（如Beckman Optima 台式超速离心机离心管），弃沉淀（未破裂细胞）。
7、在上清（细菌裂解液）中加入5 mL 预冷的溶液C，轻柔颠倒混匀后冰浴放置30-60 分钟。其间可以轻柔颠倒混匀3-5 次。
8、用 Bechman Optima 台式超速离心机115，000g 4℃离心60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。
9、小心移弃上清，在沉淀中加入0.2 mL 溶液A，充分吹打混匀。
10、用Beckman Optima 台式超速离心机 115，000g 4℃离心60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。
11、小心移弃上清，所得沉淀放-20℃长期保存，也可以直接加入0.1 mL 自备的，跟后续实验兼容的缓冲液（如1×SDS-PAGE 上样液中，可从本公司购买），所得膜蛋白的浓度将在1mg/mL 左右。
用法二：大量制备（主要用于上样量比较大的2D 电泳等实验）
1、收集 200-400 mL 过夜培养的细菌饱和培养液（OD420 在1.5 左右即可），2500 g 室温离心10 分钟后弃上清。
2、加入 20 mL 溶液A，轻柔吹打，将细菌重悬于溶液A 中。
3、2500 g 室温离心10 分钟后弃上清。
4、加入 5 mL 溶液B（必须已经提前加入了DNase I 干粉），轻柔吹打使细菌重悬。注：如果细菌起始量没有200-400 mL，溶液A 的用量可以等比例降低。
重悬在溶液A 中的细菌可以放-80℃长期保存。
5、用超声或French Press 方法裂解细胞。如果用French Press 方法，则需要处理至少两次，每次的压力为9.65×10E7（=14000 psi）。注意：不论用哪种裂解方法，都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解，否则还需要重复细菌裂解过程，直到80%以上的细菌都裂解为止。
6、2500g 室温离心8 分钟后小心转移上清到干净的玻璃烧杯中，弃沉淀（未破裂细胞）。
7、在上清（细菌裂解液）中加入50 mL 预冷的溶液C，轻轻在冰浴中搅拌混匀30-60 分钟。注：可以在大烧杯中装冰，然后将装有样品的小烧杯放入，在放入干净的搅拌子，以最低速度搅拌。
8、用 Beckman Type 55.2 Ti 转头 115，000g 4℃离心60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致。
9、小心移弃上清，在沉淀中加入2 mL 溶液A，充分吹打混匀。
10、用Beckman Type 55.2 Ti 转头 115，000g 4℃离心60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致。
11、小心移弃上清，所得沉淀放-20℃长期保存或溶解在1 mL 自备的，跟后续实验兼容的缓冲液（如1×等电点电泳上样液，可从本公司购买），所得膜蛋白的浓度在1mg/mL 左右。