BTN101002 KOD DNA聚合酶

KOD DNA聚合酶说明书
产品编号：BTN101002
规格：250U
产品及特点：
KOD DNA Polymerase 是从克隆有Thermococcus Kodakaraensis DNA聚合酶基因的质粒在大肠杆菌中经诱导表达分离纯化而来。该酶所具有的超强3’→ 5’外切酶活性使得其扩增保真性比Pfu DNA Polymerase更高，保真性是Taq 的约50 倍，同时具有合成速度快的特点，聚合速度约为普通Pfu DNA Polymerase 的5倍，Taq DNA Polymerase的2倍，达到100-138 bp/秒，可以在短时间内获得高产量的扩增产物，特别适合于高保真地扩增6 kb以内的PCR 产物，扩增所得的DNA为平末端，可用于基因克隆、表达及突变分析等分子生物学实验。
规格及成分：

成分	规格
KOD DNA聚合酶 (5 U/μL)	5μl
10×KOD DNA聚合酶缓冲液	1ml
dNTP mix（10 mM Each）	0.1ml
说明书	1份

保存条件：
低温运输，-20℃保存、有效期一年。
自备试剂：
DNA模板、引物、超纯水。
使用方法：
一、建议PCR条件（以50 μL反应体系为例）

成分	体积	终浓度
模板	-	＜0.5μg
正向引物（10 μM）	1 μL	0.2 μM
反向引物（10 μM）	1 μL	0.2 μM
10×KOD DNA聚合酶缓冲液	5 μL	1×
dNTP Mixture（10mM each）	1 μL	0.2 mM
KOD DNA 聚合酶	0.25-0.5 μL（1.25-2.5U）	-
超纯水	补足到50μL	-

注：实际操作中计算好需补加水的量后，建议先加水，然后按上述顺序添加其它成分，最后添加KOD DNA聚合酶。最好在冰浴上混合PCR各种成分，防止KOD DNA聚合酶降解引物和模板。待各成分充分混匀后，离心数秒，使反应混合物沉到管底。然后将反应管置于PCR仪中进行扩增。
二、关于
PCR条件的优化
1. 质粒或者噬菌体模板（模板量5-20ng，循环参数如下表）

循环参数	目标DNA<1 kb	目标DNA<2 kb	目标DNA3-4 kb	目标DNA5-6 kb
Step 1	94℃ 2分钟	94℃ 2分钟	94℃ 2分钟	94℃ 2分钟
Step 2	94℃ 20秒	94℃ 20秒	94℃ 20秒	94℃ 30秒
Step 3	Ta 20秒	Ta 20秒	Ta 20秒	Ta 30秒
Step 4	72℃ 20秒	72℃ 30秒	72℃ 40秒	72℃ 60秒
Step 5	72℃ 5分钟	72℃ 5分钟	72℃ 5分钟	72℃ 5分钟
Repeat step 2-4 for 30-35个循环
Ta= Tm－5℃

2. 基因组DNA和cDNA模板（基因组DNA模板量为50-100 ng，1-2 μL cDNA（起始转录用的RNA为500 ng），循环参数如下表）

循环参数	目标DNA<2 kb
Step 1	94℃ 2分钟
Step 2	94℃ 20-30秒
Step 3	Ta 15-20秒
Step 4	72℃ 20-60秒
Step 5	72℃ 5分钟
Repeat step 2-4 for 30-35个循环
Ta= Tm - 5℃

活性定义：
1 U指 75℃条件下，30分钟内使10 nmoles的 dNTPs 掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。