BTN101102 改良Lowry法蛋白定量试剂盒

改良Lowry法蛋白定量试剂盒说明书
产品编号：BTN101102
规格：1000T
产品及特点：
Folin 酚试剂（磷钼酸和磷钨酸混合物）跟蛋白质中含酚氨基酸（色氨酸和酪氨酸）发生颜色反应，可用于测定蛋白质浓度，但灵敏度较低。Lowry在此基础上加入Biuret（双缩脲）反应步骤，即先在碱性条件下使蛋白质和Cu+形成复合物，再使其与Folin 酚试剂发生显色反应，产物在750nm检测。
Lowry 法使不含酚的蛋白质也能被检测出来，灵敏度是单独使用Folin酚的10倍左右，是双缩脲反应的200倍，因此成为早期检测蛋白浓度的主要方法。
Lowry 检测原理图如下：
 
传统Lowry 法受到很多常用的试剂（如DTT、糖、甘油、Triton 等）干扰，步骤繁琐。本公司对Lowry 法进行改良，具有下列特点:
1. 即开即用，不需要单独购买每个成分再配制。
2. 能抵抗部分干扰物（如一定浓度SDS 或其他去污剂）的干扰。
3. 检测线性范围广，在2-100μg，检测上限比经典Lowry 法高30%-40%。
规格及成分：

成分	规格
溶液A 成分一	208ml
溶液A 成分二	16ml
溶液A 成分三	16ml
溶液B	80ml
溶液C	80ml
福林酚	10 mL（用100 mL 棕色瓶）
BSA标准品（2 mg/mL in水）	1ml
说明书	1份

保存条件：
常温运输和保存（但BSA 标准品需要-20℃保存），有效期一年。
自备试剂：
去离子水、蛋白样品、样品缓冲液。
使用方法：
一：准备工作
1、制备溶液A：将16 mL 溶液A 成分二和16 mL 溶液A 成分三加入到装溶液A 成分一的塑料瓶中，混合均匀得到240 mL 溶液A。注意：溶液A各成分分开提供更加稳定。
2、制备 Lowry 工作液：将溶液A、溶液B 和溶液C 按3：1：1 的体积比混合得到Lowry 工作液。此工作液可以室温放置2-3 周，所以最好用多少配多少。如果发现溶液B 或溶液C 有沉淀，需37℃溶解并摇匀后再使用。
3、制备福林酚工作液：在装有10 mL 福林酚的棕色塑料瓶中加入90 mL 去离子水，摇晃混匀待用。此工作液在避光条件下可以放置6 个月。
二：试管法

1. 先用去离子水将BSA 标准（2 mg/mL）稀释到50 μg/mL，然后在标记的试管中加入下列成分（单位：μL）。注意：每个样品最好做三个稀释度，每个稀释度最好设置三次重复，阴性对照和标准品也最好做三次重复。

标准品（每个做三次重复，此处只列出一个）
编号	BSA 标准（50 μg/mL）	水	总体积
阴性对照	0	0	200
1	0	200	200
2	25	175	200
3	50	150	200
4	100	100	200
5	150	50	200
6	200	0	200
样品（以1 个样品、3 个稀释度为例，每个稀释度三个重复，此处只列出一个）
编号	样品		总体积
1	200 （稀释度1）		200
阴性对照1	200（用稀释度1 稀释的溶解蛋白样品的缓冲液）		200
2	200 （稀释度2）		200
阴性对照2	200（用稀释度2 稀释的溶解蛋白样品的缓冲液）		200
3	200 （稀释度3）		200
阴性对照3	200（用稀释度3 稀释的溶解蛋白样品的缓冲液）		200

5、每管中加入200 μL Lowry 工作液，振荡混匀后室温反应10 分钟。
6、每管中加入100 μL 福林酚工作液，振荡混匀后室温反应30 分钟。
7、用容量为0.5 mL、光径为1 cm 的玻璃比色杯或聚苯乙烯比色杯测定750nm 的光吸收。测定时，先空白（即阴性对照）后样品，测定样品和BSA标准品时，先低浓度后高浓度。测定未知样品前需要将杯子清洗干净，必要时可以用甲醇清洗吸附到比色杯壁上的染料。
8、根据标准品三个重复的平均值绘制标准曲线，然后根据未知样品的光吸收从标准曲线中查得其对应的浓度。
三：96 微孔板法
9、同上，只是反应用96 微孔板设置，用酶标测试仪750 nm 测定光吸收。
四、样品中干扰物质的去除（本产品不含相关产品，
如果样品中有干扰Lowry 法蛋白定量的物质（见附表），可另购本公司的微量蛋白质沉淀试剂盒（BTN81217）去除，也可以用自备试剂按下法去除：用水将样品调到体积为200 μL, 加入20 μL 0.15%去氧胆酸钠，混匀，室温放置10 分钟。加入20μL 72%的TCA，室温放置5 分钟。3000 g离心15 分钟，小心去除上清。用200μl水溶解蛋白沉淀后以用于Lowry 法测定。
附：常见Lowry 法蛋白定量干扰物（低于所列浓度不干扰，高于所列浓度则会干扰，需要按上法去除。不能含任何浓度的DTE，DTT 和硫酸胺)。

干扰物	浓度	干扰物	浓度
Acetone	10%	2-Mercaptoethanol	1 mM
Aprotinin	10 mg/mL	NaCl	1 M
CHAPS	0.05%	NaOH	100 mM
DMF	10%	NaPi	100 mM
DMSO	10%	NP40	0.02%
EDTA	1 mM	PMSF	1 mM
EGTA	1 mM	SDS	1%
Ethanol	10%	Sodium Citrate	100 mM
Glucose	100 mM	Sucrose	7%
Glycin	100 mM	Tris	10 mM
HEPES	1 mM	Trition X-100	0.03%
Imidazole	25 mM	Tween 20	0.05%
Methanol	10%	Urea	3M

疑难解答：
1. 该方法检测的蛋白质浓度范围1μg-50μg/ml。
2. 由于 Lowry 法测定的是蛋白质中酪氨酸残基，对于那些酪氨酸残基数高于或低于BSA,其测定的蛋白质含量将偏低或偏高。如果遇到该情况，需要采用BCA 或Bradford 法测定。
3. 阅读测定方法后化学试剂对测定方法的影响。