BTN101104 3'-RACE试剂盒

3'-RACE试剂盒说明书
产品编号：BTN101104
规格：10次
产品及特点：
研究真核基因的最基础的工作之一就是确定其转录终止位点，目前最通用的方法是3′-RACE法，RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是Frohman发明的、通过PCR快速克隆cDNA末端的技术，它在不建立cDNA文库的前提下，利用已知cDNA序列设计引物，通过往两端延伸和扩增获得其3′-端序列。本试剂盒就是根据3′-RACE原理而开发，它具有下列特点：
1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。
2. 反应条件经过精心优化，包括使用无RNase H活性的MMLV和优化的引物。
3′-RACE的原理如下图：
 
规格及成分：

成分	规格
MMLV逆转录酶-RI混合物（RNase H-，200 U/μL）	10μl
MMLV Buffer（含dNTP）	50μl
PCR MagicMix 2.0（含酶和染料）	1.5ml
3′-RACE引物A（10μM）	10μl
3′-RACE引物B（10μM）	100μl
3′-RACE引物C（10μM）	100μl
RNase-Free水	1ml
说明书	1份

保存条件：
低温运输、-20℃保存、有效期一年。
自备试剂：
Poly(A) RNA（或总RNA）、基因专一性引物A、基因专一性引物B、超纯水。
使用方法：
一：利用含Oligo(dT)的3′-RACE引物A进行逆转录
注意：MMLV酶使用前必须短暂离心，因为它含50%甘油，及其粘稠，否则将取不到所需体积。

• 在一个PCR管中，加入以下组分：

成分	用量
Poly(A)RNA（或总RNA）	0.2-2 μg（5μg）
3′-RACE引物A（10μM）	1μL
MMLV Buffer (含dNTP溶液)	5μL
RNase-Free水	补至19μL
合计	19μL

注意：如果可能，最好使用Poly(A) RNA作为模板。
65℃保温5分钟，展开RNA的二级结构，立即冰浴待用。
2. 再在上述PCR管中加入1 μL MMLV逆转录酶-RI混合物（200 U/μL）。
3. 37℃保温60分钟，42℃保温30分钟进行逆转录反应；然后50℃保温10分钟终止反应。
4. 加入0.5 mL RNase-free水稀释上步得到的cDNA，冰浴待用。长期放置需要放-20℃保存。
二：利用基因专一性引物A和3′ RACE引物B进行第一轮PCR

• 用不同量的RT反应液（稀释后的cDNA）设置PCR（样品组最好设置用量梯度，单位：μL）。

成分	梯度1	梯度2	梯度3	梯度4
稀释后的cDNA	1	5	10	15
基因专一性引物A（10μM）	2.5	2.5	2.5	2.5
3′ RACE引物B（10μM）	2.5	2.5	2.5	2.5
98℃ 5分变性RNA-cDNA杂交链，短暂离心后再加入下列成分
PCR MagicMix 2.0	25	25	25	25
RNase-free水	19	15	10	5
合计	50	50	50	50

• 按下列条件进行PCR（注：应根据实际情况选择适当的退火温度）。

第1次循环：52-60℃ 2分，72℃ 40分（此步的目地是合成第二链的cDNA，复性温度需要根据自备基因专一性引物A的Tm值进行优化，一般可以从55℃开始）。
第2-30次循环：94℃ 1分钟，52-60℃ 1分，72℃ 3分（此步为PCR扩增，复性温度需要根据自备基因专一性引物A的Tm值进行优化，一般可以从55℃开始）。
最后延伸：72℃ 15分
7. 取5 μL的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳以确认PCR扩增产物。若得到目的扩增产物需要用于后续实验，请于-20℃保存；若没有得到目的扩增产物，可按下列步骤进行巢式PCR反应。
三：利用基因专一性引物B和3′ RACE引物C进行巢式PCR反应

• 将上轮PCR产物（4管）均用水稀释稀释20倍，然后每管均用巢式PCR进行扩增。巢式PCR反应设置如下：

成分	用量
PCR MagicMix 2.0	25μl
上步得到的PCR反应液（稀释20倍后）	1μl
基因专一性引物B（10 μM）	2.5μl
3′ RACE引物C（10 μM）	2.5μl
超纯水	补至50μL

9. PCR反应。按下列条件进行PCR：
第1-30次循环：94℃ 1分钟，52-60℃ 1分，72℃ 3分（复性温度需要根据自备基因专一性引物B的Tm值进行优化，一般可以从55℃开始）最后延伸：72℃ 15分

• 电泳检测。然后根据实验结果进行DNA测序或TA克隆。

注意事项：
1. 如果两轮PCR得到的非特异产物多，可以在RT反应是继续降低3′-RACE引物A的用量。
2. 自备的基因专一性引物的GC含量最好跟3′-RACE引物B和引物C的一致，后者长度均为18nt，均含11个G（或C），7个A（或T）。