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BTN101105 5'-RACE试剂盒
发布时间：2017-10-01 11:24 | 点击次数：261
5'-RACE试剂盒说明书
产品编号：BTN101105
规格：10T
产品及特点：
研究真核基因的最基础的工作之一就是确定其转录终止位点，目前最通用的方法是5′-RACE法，RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是Frohman发明的、通过PCR快速克隆cDNA末端的技术，它在不建立cDNA文库的前提下，利用已知cDNA序列设计引物，通过往两端延伸和扩增获得其5′-端序列。本试剂盒就是根据5′-RACE原理而开发，它具有下列特点：
1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。
2. 反应条件经过精心优化，包括使用无RNase H活性的MMLV和优化的引物。
5′-RACE的原理如下图：
规格及成分：
保存条件：
低温运输、-20℃保存、有效期一年。
自备试剂：
Poly(A) RNA（或总RNA）、基因专一性引物A、B、C、75%乙醇。注意：自备的基因专一性引物A，B，C的相对位置应该跟本手册产品介绍中的示意图一致。
使用方法：
1. 变性模板RNA：将1μg mRNA或5μg总RNA加入到一个RNase-free的PCR管中，补RNase-Free水到9μL，65℃保温5分钟后短暂离心，立即放冰上待用。如果RNA浓度偏低，体积超过9 μL,可以使用本公司的核酸浓缩剂（需另购,产品编号为BTN110801）浓缩到所需的体积。
2. 设置RT反应（用户可以根据需要设阴性对照）：在上步的含变性后的RNA模板的PCR管中，按顺序加入：
3. 37℃保温60分钟， 42℃保温30分钟， 50℃保温10分钟，最后75℃保温10分钟使逆转录酶变性。
4. 短暂离心5秒后待用。
5. 在PCR管中加入40 μL微量核酸沉淀剂（本产品含不溶的核酸助沉剂，用前需要充分摇匀再取用），震荡混匀。
6. 室温12000 rpm离心15分钟，小心吸弃上清。
7. 加入1mL 自备75%乙醇，室温12000 rpm离心5分钟，小心吸弃上清。
8. 短暂离心数秒，小心吸弃残留液体后，稍微晾干后加入10μL RNase-free水，充分吹打溶解，得到cDNA溶液。注意：为保证加尾效率，溶解cDNA的RNase-free水最好不要超过10 μL。
9. 加尾反应：在10μL cDNA溶液中加10μL 2×TdT Buffer（含dATP）和1μL TdT酶，轻柔吹打混匀。
10. 37℃保温15分钟进行加尾反应，然后75℃保温3分钟灭活末端转移酶。
11. 加入0.5 mL RNase-free水稀释加尾反应体系。此稀释液将作为PCR的模板。
12. 第一轮PCR：用不同量的稀释后的加尾反应液设置PCR反应（样品组最好设用量梯度，单位：μL）。
13. 按下列条件进行 PCR（注：应根据实际情况选择适当的退火温度）。
第 1 次循环：94℃ 5 分，48-52℃ 2 分，72℃ 4 分
第 2-30 次循环：94℃ 40 秒，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分
最后延伸：72℃ 15 分
14. 取10-20μL PCR产物进行琼脂糖电泳电泳检查PCR结果，如果一条清晰的条带，则可以不做后续的第二轮PCR，而直接进行 DNA 测序或TA克隆。
15. 第二轮PCR：如果第一轮PCR没有一条清晰的条，则带从4管PCR产物中各取1μL分别加入到20μL RNase-free水中进行稀释，然后各取1μL分别作为4管第二轮PCR的模板：
16. 按下列条件进行 PCR：第 1-30 次循环（94℃ 40 秒，52-60℃ 1 分，72℃ 3分），最后延伸：72℃ 15 分
17. 取10-20μL第二轮 PCR 产物进行琼脂糖电泳，一般都会有一个样品有清晰的条带出现，则可以直接进行DNA测序或TA克隆。
产品编号：BTN101105
规格：10T
产品及特点：
研究真核基因的最基础的工作之一就是确定其转录终止位点，目前最通用的方法是5′-RACE法，RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是Frohman发明的、通过PCR快速克隆cDNA末端的技术，它在不建立cDNA文库的前提下，利用已知cDNA序列设计引物，通过往两端延伸和扩增获得其5′-端序列。本试剂盒就是根据5′-RACE原理而开发，它具有下列特点：
1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。
2. 反应条件经过精心优化，包括使用无RNase H活性的MMLV和优化的引物。
5′-RACE的原理如下图：
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| MMLV逆转录酶-RI混合液 （RNase H-，200 U/μL） |
10μl |
| MMLV Buffer-dNTP混合液 | 60μl |
| 微量核酸沉淀剂 | 400μl |
| TdT（末端转移酶） | 10μl |
| 2×TdT Buffer（含dATP） | 100μl |
| PCR MagicMix 3.0 | 1.5ml |
| 5′-RACE引物A-引物B混合液 | 100μl |
| 5′-RACE引物C | 100μl |
| RNase-Free水 | 1ml |
低温运输、-20℃保存、有效期一年。
自备试剂：
Poly(A) RNA（或总RNA）、基因专一性引物A、B、C、75%乙醇。注意：自备的基因专一性引物A，B，C的相对位置应该跟本手册产品介绍中的示意图一致。
使用方法：
1. 变性模板RNA：将1μg mRNA或5μg总RNA加入到一个RNase-free的PCR管中，补RNase-Free水到9μL，65℃保温5分钟后短暂离心，立即放冰上待用。如果RNA浓度偏低，体积超过9 μL,可以使用本公司的核酸浓缩剂（需另购,产品编号为BTN110801）浓缩到所需的体积。
2. 设置RT反应（用户可以根据需要设阴性对照）：在上步的含变性后的RNA模板的PCR管中，按顺序加入：
| 成分 | 用量 |
| 自备的基因专一性引物A（10μM） | 4μl |
| MMLV Buffer-dNTP混合液 | 6μl |
| MMLV逆转录酶-RI混合液 | 1μl |
| 合计 | 20μl |
4. 短暂离心5秒后待用。
5. 在PCR管中加入40 μL微量核酸沉淀剂（本产品含不溶的核酸助沉剂，用前需要充分摇匀再取用），震荡混匀。
6. 室温12000 rpm离心15分钟，小心吸弃上清。
7. 加入1mL 自备75%乙醇，室温12000 rpm离心5分钟，小心吸弃上清。
8. 短暂离心数秒，小心吸弃残留液体后，稍微晾干后加入10μL RNase-free水，充分吹打溶解，得到cDNA溶液。注意：为保证加尾效率，溶解cDNA的RNase-free水最好不要超过10 μL。
9. 加尾反应：在10μL cDNA溶液中加10μL 2×TdT Buffer（含dATP）和1μL TdT酶，轻柔吹打混匀。
10. 37℃保温15分钟进行加尾反应，然后75℃保温3分钟灭活末端转移酶。
11. 加入0.5 mL RNase-free水稀释加尾反应体系。此稀释液将作为PCR的模板。
12. 第一轮PCR：用不同量的稀释后的加尾反应液设置PCR反应（样品组最好设用量梯度，单位：μL）。
| 成分 | 梯度1 | 梯度2 | 梯度3 | 梯度4 |
| PCR MagicMix 3.0 | 25 | 25 | 25 | 25 |
| 自备基因专一性引物B（10 μM） | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
| 5′ RACE引物 A-引物B混合液 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
| 稀释后的加尾反应液 | 1 | 5 | 10 | 15 |
| RNase-free 水 | 19 | 15 | 10 | 5 |
| 合计 | 50 | 50 | 50 | 50 |
第 1 次循环：94℃ 5 分，48-52℃ 2 分，72℃ 4 分
第 2-30 次循环：94℃ 40 秒，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分
最后延伸：72℃ 15 分
14. 取10-20μL PCR产物进行琼脂糖电泳电泳检查PCR结果，如果一条清晰的条带，则可以不做后续的第二轮PCR，而直接进行 DNA 测序或TA克隆。
15. 第二轮PCR：如果第一轮PCR没有一条清晰的条，则带从4管PCR产物中各取1μL分别加入到20μL RNase-free水中进行稀释，然后各取1μL分别作为4管第二轮PCR的模板：
| 成分 | 用量 |
| 第一轮 PCR 产物的稀释液 | 1μl |
| PCR MagicMix 3.0 | 25μl |
| 5′RACE 引物 C | 2.5μl |
| 自备基因专一性引物 C（10 μM） | 2.5μl |
| RNase-free 水 | 补水至50μl |
| 合计 | 50μl |
17. 取10-20μL第二轮 PCR 产物进行琼脂糖电泳，一般都会有一个样品有清晰的条带出现，则可以直接进行DNA测序或TA克隆。