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BTN101114 通用型RT-LAMP试剂盒
发布时间：2017-10-01 11:32 | 点击次数：333
通用型RT-LAMP试剂盒说明书
产品编号：BTN101114
规格：50T
产品及特点：
本产本试剂盒可以用于RT-LAMP等温扩增，RT-LAMP即逆转录和Loop-Mediated Isothermal Amplification（环介导等温扩增）的结合，专门用于快速扩增RNA。LAMP是2000年才出现的一种新颖的等温核酸扩增方法。它利用4或6条模板专一的特异引物和具有链置换能力的DNA 聚合酶，在等温条件下(63℃左右) 30－60分钟完成扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于RT-PCR技术，同时还不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，不依赖任何专门的仪器设备。目前已成功应用于人类及动植物、细菌、病毒、寄生虫、真菌等病原体的快速检测。本试剂盒具有下列特点：
1. 高特异性，由于同时使用4-6条特异引物，所以特异性比RT-PCR更高。
2. 高扩增效率，扩增效率可达到10E9-10E10，比PCR灵敏一个数量级，可检测到单拷贝的RNA分子
3. 65℃左右完成RT和LAMP扩增，不需要贵重的热循环仪。
4. 即开即用，包含了除引物和模板RNA外的所有成份，十分方便。
5. 肉眼检测扩增结果，不需要昂贵的电泳、荧光PCR等仪器。
6. 提供扩增对照，便于在遇到困难时分析原因。
规格及成分：
注：RT-LAMP Mix（2×）稀释到1×时，已经有8mM Mg2+，本试剂盒提供的MgCl2（25 mM）用于用户优化条件用。
保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
RNA模板及RT-LAMP引物（4或6条）。
使用方法：
1. 在冰上溶解除酶外的各种组份，混匀，稍离心。在反应管中加入以下组份：
注：如在反应管中加入本公司PCR级绿如蓝染料1μL（水则少加1μL），则可直接在荧光定量PCR仪中进行荧光定量检测。
2. 混匀，置于60-65℃保温30-120分钟。注意：如果不使用Loop引物，则最好保温120分钟；如果使用Loop引物，则最好保温30分钟。
3. 80℃10分钟灭活Bst DNA聚合酶。此酶有外切酶活性，所以必须灭活。
4. 产物置于-20℃备用或立即用于下游检测。扩增产物可选下列方法之一检测:
1) 琼脂糖凝胶电泳。取扩增产物5μL，1-2%的琼脂糖凝胶电泳，可见LAMP特征性电泳图谱；
2) 向扩增产物中直接加入本公司PCR级绿如蓝染料（另售）1μL，混匀，稍离心。将反应管置于紫外透射仪或凝胶成像系统中，紫外灯下可见绿色荧光产生；
3) 荧光定量检测。
5. 结果分析：
1) 如果没有扩增，则需要用本试剂提供的阳性对照进行扩增。本试剂盒提供阳性对照，反应按下表设置：
混匀后，置于60℃保温120分钟，其余操作同上。注意：本对照引物中没有Loop引物，所以最好保温120分钟。
如果阳性对照能够扩增出，则说明试剂盒没有问题，可能是模板或引物的问题。如果阳性对照没有扩增出条带，则是试剂盒的问题，请跟厂家联系。
注意事项：
1. 引物设计对成功扩增十分关键。除用于SNP分型外，尽量以保守区设计引物。
2. 引物至少包括F3/B3和FIP/BIP，加入环状引物F loop/B loop可以使反应速度大大提高。
3. 应优化引物序列、GC含量和尽量避免二级结构。
4. 反应中各个引物的浓度及比例对扩增效果有一定的影响。
5. 建议先将所有引物混合在一起，配制成10.浓度以方便使用。
6. LAMP扩增具有特异性好、灵敏度高、时间快、不需要特殊仪器设备等优点。但太高的灵敏度使得其比普通PCR扩增更加容易污染导致假阳性。因此，必须高度重视扩增产物的污染。常规措施包括严格的实验分区、添加UNG和dUTP（可能导致反应效率下降）、使用荧光定量等不开盖检测方法。实验室一旦遭到污染，所有相关试剂必须全部更换，必要时还得更换实验室。
7. 要确证扩增的为目标基因，可以使用特定的限制性酶切和/或Southern杂交。
8. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品等用途。
产品编号：BTN101114
规格：50T
产品及特点：
本产本试剂盒可以用于RT-LAMP等温扩增，RT-LAMP即逆转录和Loop-Mediated Isothermal Amplification（环介导等温扩增）的结合，专门用于快速扩增RNA。LAMP是2000年才出现的一种新颖的等温核酸扩增方法。它利用4或6条模板专一的特异引物和具有链置换能力的DNA 聚合酶，在等温条件下(63℃左右) 30－60分钟完成扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于RT-PCR技术，同时还不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，不依赖任何专门的仪器设备。目前已成功应用于人类及动植物、细菌、病毒、寄生虫、真菌等病原体的快速检测。本试剂盒具有下列特点：
1. 高特异性，由于同时使用4-6条特异引物，所以特异性比RT-PCR更高。
2. 高扩增效率，扩增效率可达到10E9-10E10，比PCR灵敏一个数量级，可检测到单拷贝的RNA分子
3. 65℃左右完成RT和LAMP扩增，不需要贵重的热循环仪。
4. 即开即用，包含了除引物和模板RNA外的所有成份，十分方便。
5. 肉眼检测扩增结果，不需要昂贵的电泳、荧光PCR等仪器。
6. 提供扩增对照，便于在遇到困难时分析原因。
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| RT-LAMP Mix（2×） | 0.5ml |
| AMV-Bst混合液 | 75μl |
| 对照引物混合物 | 40μl |
| 对照模板 | 5μl |
| MgCl2（25 mM） | 0.2ml |
| RNase-free水 | 1ml |
| 说明书 | 1份 |
保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
RNA模板及RT-LAMP引物（4或6条）。
使用方法：
1. 在冰上溶解除酶外的各种组份，混匀，稍离心。在反应管中加入以下组份：
| 成份 | 样品管 | 阴性对照 |
| RT-LAMP Mix（2×） | 10μl | 10μl |
| 自备FIP引物终浓度 | 0.8μM | 0.8μM |
| 自备BIP引物终浓度 | 0.8μM | 0.8μM |
| 自备F3引物终浓度 | 0.2μM | 0.2μM |
| 自备B3引物终浓度 | 0.2μM | 0.2μM |
| 自备Loop F引物终浓度（可选项） | 0.4μM | 0.4μM |
| 自备Loop B引物终浓度（可选项） | 0.4μM | 0.4μM |
| 自备模板 RNA | 1-100ng | 不加 |
| AMV-Bst 混合液 | 1.5μl | 1.5μl |
| 补水到 | 20μl | 20μl |
2. 混匀，置于60-65℃保温30-120分钟。注意：如果不使用Loop引物，则最好保温120分钟；如果使用Loop引物，则最好保温30分钟。
3. 80℃10分钟灭活Bst DNA聚合酶。此酶有外切酶活性，所以必须灭活。
4. 产物置于-20℃备用或立即用于下游检测。扩增产物可选下列方法之一检测:
1) 琼脂糖凝胶电泳。取扩增产物5μL，1-2%的琼脂糖凝胶电泳，可见LAMP特征性电泳图谱；
2) 向扩增产物中直接加入本公司PCR级绿如蓝染料（另售）1μL，混匀，稍离心。将反应管置于紫外透射仪或凝胶成像系统中，紫外灯下可见绿色荧光产生；
3) 荧光定量检测。
5. 结果分析：
1) 如果没有扩增，则需要用本试剂提供的阳性对照进行扩增。本试剂盒提供阳性对照，反应按下表设置：
| 成份 | 阳性对照管 |
| RT-LAMP Mix（2×） | 10μl |
| 对照引物混合物 | 4.0μl |
| 对照模板 | 1μl |
| AMV-Bst 混合液 | 1.5μl |
| 水 | 3.5μl |
如果阳性对照能够扩增出，则说明试剂盒没有问题，可能是模板或引物的问题。如果阳性对照没有扩增出条带，则是试剂盒的问题，请跟厂家联系。
注意事项：
1. 引物设计对成功扩增十分关键。除用于SNP分型外，尽量以保守区设计引物。
2. 引物至少包括F3/B3和FIP/BIP，加入环状引物F loop/B loop可以使反应速度大大提高。
3. 应优化引物序列、GC含量和尽量避免二级结构。
4. 反应中各个引物的浓度及比例对扩增效果有一定的影响。
5. 建议先将所有引物混合在一起，配制成10.浓度以方便使用。
6. LAMP扩增具有特异性好、灵敏度高、时间快、不需要特殊仪器设备等优点。但太高的灵敏度使得其比普通PCR扩增更加容易污染导致假阳性。因此，必须高度重视扩增产物的污染。常规措施包括严格的实验分区、添加UNG和dUTP（可能导致反应效率下降）、使用荧光定量等不开盖检测方法。实验室一旦遭到污染，所有相关试剂必须全部更换，必要时还得更换实验室。
7. 要确证扩增的为目标基因，可以使用特定的限制性酶切和/或Southern杂交。
8. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品等用途。