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BTN111009 端粒酶重复片段扩增试剂盒
发布时间：2017-10-01 11:34 | 点击次数：394
端粒酶重复片段扩增试剂盒说明书
产品编号：BTN111009
规格：50T
产品及特点：
端粒酶存在于85-90%的肿瘤组织中，因此通过检测端粒酶活性就能早期诊断大多数肿瘤。目前最常用的检测端粒酶活性的方法就是TRAP (telomeric repeat amplification protocol，端粒重复片段扩增)，它利用端粒酶能在外加的TS模板DNA的末端添加不同数量的TTAGGG序列这一特点，通过PCR检测延伸产物而高效检测端粒酶活性。本品是百奥莱博公司在经典TRAP技术基础上改良而得，专门用于快速测定人类细胞端粒酶的相对活性（需要跟对照样品比较）。它具有以下特征：
1. 一站式，提供从细胞裂解到PCR的所有试剂，但不含PAGE和银染试剂。
2. 一管式操作，端粒酶延伸和PCR在同一体系中完成，方便快捷。
3. 提供改良的、长为150 bp的内参和含8个端粒序列的合成端粒，可有效排除PCR假阴性。内参长度远大于TRAP产物，不会干扰结果分析。
4. 改良的TS模板和PCR引物，极大降低了引物二聚体的形成。
5. 既可用于培养细胞，也可用于实体组织。
6. 灵敏度高，最低可以检测到10个肿瘤细胞中的端粒酶活性。
规格及成分：
保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
PAGE电泳及银染试剂盒。
使用方法：
一：端粒酶的提取
注意：端粒酶是蛋白质和RNA组成的复合体，RNA极容易被降解，因此，提取端粒酶应该跟提取RNA一样，尽量在低温条件下快速操作，并且必须使用RNase-free的耗材，桌面最好用固相RNase清除剂清洁（BTN3090）清洁。
1. 对冷冻的实体组织：将50-100mg冷冻组织在液氮中用预冷的研磨器研磨成粉末，再转移到预冷的玻璃匀浆器中，加入200 μL 预冷的TRAP细胞裂解液，温和手动匀浆数次后冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6 次，然后直接进入第3步操作。为保证裂解效果，可在显微镜下观察。如果组织样品不足50-100 mg，可以按比例降低TRAP细胞裂解液的用量。
2. 对新鲜的培养细胞和组织：用自备的预冷PBS洗涤105-106个经过胰酶处理的细胞或50-100 mg新鲜组织，3000g 4℃离心5分钟，弃上清；加入200μL预冷的TRAP细胞裂解液悬浮细胞或组织。对细胞：涡旋振荡10秒后置冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6次。对组织：在冰上用玻璃匀浆器轻柔匀浆后冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6次。如果细胞不足1×106或50-100 mg，可按比例降低TRAP裂解液的用量。
3. 12000-14000 g 4℃离心20分钟。
4. 收集160 μL上清，先取部分用于测定蛋白质浓度，可通过测定215nm和225nm的光吸收得到，计算公式是蛋白质浓度（μg/μL）=0.144×（A215-A225）×稀释倍数，也可使用BCA法测定蛋白浓度。本试剂盒制备的细胞裂解物的蛋白浓度一般在10-750 ng/μL。知道各样品的蛋白浓度后，可用TRAP细胞裂解液将各样品的蛋白浓度调成一样便于比较，然后按10μL/管分装得到至少15管裂解物，放-80℃冷冻保存（可存放一年）。每个样品可取一管进行热灭活（95℃处理10分钟）后再放-80℃冷冻保存，此管将作为该样品的阴性对照。
二：TRAP反应
注：为避免污染，最好等其他样品加完并盖上盖后再加合成端粒。
三：PAGE-银染检测及结果解读（本试剂盒不含PAGE-银染检测试剂盒）
8. 取5μL PCR反应液进行10%非变性PAGE电泳-银染显色实验（需另购本公司PAGE电泳套装和银染试剂盒）。如果背景高（主要是由反应体系中的蛋白成分引起），可以先进行PCR产物纯化再进行PAGE电泳和银染。
9. 跟预期结果（见下表）比较。如果结果跟下表不一致，则需要按具体情况分析原因。
注：本试剂盒所用引物产生的典型TRAP条带最小条带为59bp。
疑难解答：
1. 如果样品管有内参带，但没有TRAP条带，可能是端粒酶活性低或者失活。制备细胞裂解物时可在TRAP细胞裂解液中加入1/100体积的RNase抑制剂以抑制RNase活性，并在端粒延伸反应后增加DNA纯化一步，纯化后的DNA再用于PCR。此两步法TRAP需要用户自备DNA纯化试剂和dNTP。
2. 如果样品对照管（端粒酶已经灭活）出现TRAP条带，可能是TRAP产物污染，需要使用洁净的PCR管和PCR试管架。样品制备、PCR设置和电泳需在不同房间进行。也可能是端粒酶没有彻底灭活，建议用RNase酶解法或酶解+热灭活法。
3. 实验阴性对照管的实验结果中出现TRAP条带，可能是引物二聚体，可采取两步法TRAP，并且将DNA模板加入到70℃预热的PCR Mix3.0中再进行PCR。
4. 实验结果不好时，可以直接采取2步法，先做端粒酶延伸和灭活，然后再纯化DNA，用纯化的DNA做PCR。此法需要用户自备dNTP。
产品编号：BTN111009
规格：50T
产品及特点：
端粒酶存在于85-90%的肿瘤组织中，因此通过检测端粒酶活性就能早期诊断大多数肿瘤。目前最常用的检测端粒酶活性的方法就是TRAP (telomeric repeat amplification protocol，端粒重复片段扩增)，它利用端粒酶能在外加的TS模板DNA的末端添加不同数量的TTAGGG序列这一特点，通过PCR检测延伸产物而高效检测端粒酶活性。本品是百奥莱博公司在经典TRAP技术基础上改良而得，专门用于快速测定人类细胞端粒酶的相对活性（需要跟对照样品比较）。它具有以下特征：
1. 一站式，提供从细胞裂解到PCR的所有试剂，但不含PAGE和银染试剂。
2. 一管式操作，端粒酶延伸和PCR在同一体系中完成，方便快捷。
3. 提供改良的、长为150 bp的内参和含8个端粒序列的合成端粒，可有效排除PCR假阴性。内参长度远大于TRAP产物，不会干扰结果分析。
4. 改良的TS模板和PCR引物，极大降低了引物二聚体的形成。
5. 既可用于培养细胞，也可用于实体组织。
6. 灵敏度高，最低可以检测到10个肿瘤细胞中的端粒酶活性。
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| TRAP细胞裂解液 | 10mL |
| PCR Mix 3.0 | 1.5mL |
| 合成端粒(PC) | 50μL |
| TS-引物混合物（含内参） | 300μL |
| 超纯水 | 1mL |
| 说明书 | 1份 |
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
PAGE电泳及银染试剂盒。
使用方法：
一：端粒酶的提取
注意：端粒酶是蛋白质和RNA组成的复合体，RNA极容易被降解，因此，提取端粒酶应该跟提取RNA一样，尽量在低温条件下快速操作，并且必须使用RNase-free的耗材，桌面最好用固相RNase清除剂清洁（BTN3090）清洁。
1. 对冷冻的实体组织：将50-100mg冷冻组织在液氮中用预冷的研磨器研磨成粉末，再转移到预冷的玻璃匀浆器中，加入200 μL 预冷的TRAP细胞裂解液，温和手动匀浆数次后冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6 次，然后直接进入第3步操作。为保证裂解效果，可在显微镜下观察。如果组织样品不足50-100 mg，可以按比例降低TRAP细胞裂解液的用量。
2. 对新鲜的培养细胞和组织：用自备的预冷PBS洗涤105-106个经过胰酶处理的细胞或50-100 mg新鲜组织，3000g 4℃离心5分钟，弃上清；加入200μL预冷的TRAP细胞裂解液悬浮细胞或组织。对细胞：涡旋振荡10秒后置冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6次。对组织：在冰上用玻璃匀浆器轻柔匀浆后冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6次。如果细胞不足1×106或50-100 mg，可按比例降低TRAP裂解液的用量。
3. 12000-14000 g 4℃离心20分钟。
4. 收集160 μL上清，先取部分用于测定蛋白质浓度，可通过测定215nm和225nm的光吸收得到，计算公式是蛋白质浓度（μg/μL）=0.144×（A215-A225）×稀释倍数，也可使用BCA法测定蛋白浓度。本试剂盒制备的细胞裂解物的蛋白浓度一般在10-750 ng/μL。知道各样品的蛋白浓度后，可用TRAP细胞裂解液将各样品的蛋白浓度调成一样便于比较，然后按10μL/管分装得到至少15管裂解物，放-80℃冷冻保存（可存放一年）。每个样品可取一管进行热灭活（95℃处理10分钟）后再放-80℃冷冻保存，此管将作为该样品的阴性对照。
二：TRAP反应
- 确定每个TRAP反应的细胞裂解物用量：为便于分析比较，每个TRAP反应所用的蛋白量（或细胞数）必须一样。由于细胞裂解物中一般都有高浓度的不明Taq DNA聚合酶抑制物（TRAP失败最常见的原因），因此最佳结果往往是用稀释10-1000倍后的细胞裂解物得到。建议用一个样品稀释不同浓度做TRAP预实验。
| 成份 | A样品管 | A阴性对照管 | B样品管 | B阴性对照管 | 实验阴性对照 | 实验阳性对照 |
| A样品 | 2μl | - | - | - | - | - |
| A阴性对照 | - | 2μl | - | - | - | - |
| B样品 | - | - | 2μl | - | - | - |
| B阴性对照 | - | - | - | 2μl | - | - |
| TRAP细胞裂解液 | - | - | - | - | 2μl | - |
| 合成端粒 | - | - | - | - | - | 2μl |
| TS引物混合物 | 6μl | 6μl | 6μl | 6μl | 6μl | 6μl |
| PCR Mix | 25μl | 25μl | 25μl | 25μl | 25μl | 25μl |
| 超纯水 | 17μl | 17μl | 17μl | 17μl | 17μl | 17μl |
- 吹打混匀后进行PCR扩增，扩增条件（仅供参考，用户可优化）如下：
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| 端粒酶延伸 | 30℃ | 30min |
| 端粒酶灭活 | 95℃ | 5min |
| PCR（循环35次） | 94℃ | 30s |
| 55℃ | 60s | |
| 72℃ | 30s |
8. 取5μL PCR反应液进行10%非变性PAGE电泳-银染显色实验（需另购本公司PAGE电泳套装和银染试剂盒）。如果背景高（主要是由反应体系中的蛋白成分引起），可以先进行PCR产物纯化再进行PAGE电泳和银染。
9. 跟预期结果（见下表）比较。如果结果跟下表不一致，则需要按具体情况分析原因。
| 现象 | 样品管结果 | 样品阴性对照结果 | 实验阴性对照结果 | 实验阳性对照结果 |
| 典型TRAP条带（条带数不限） | 有则有端粒酶活性 无则无端粒酶活性 |
不出现 | 不出现 | 不出现 |
| 阳性对照的TRAP条带（仅8条带） | 不出现 | 不出现 | 不出现 | 出现 |
| 150bp内参 | 可出现可不出现 | 出现 | 出现 | 出现 |
疑难解答：
1. 如果样品管有内参带，但没有TRAP条带，可能是端粒酶活性低或者失活。制备细胞裂解物时可在TRAP细胞裂解液中加入1/100体积的RNase抑制剂以抑制RNase活性，并在端粒延伸反应后增加DNA纯化一步，纯化后的DNA再用于PCR。此两步法TRAP需要用户自备DNA纯化试剂和dNTP。
2. 如果样品对照管（端粒酶已经灭活）出现TRAP条带，可能是TRAP产物污染，需要使用洁净的PCR管和PCR试管架。样品制备、PCR设置和电泳需在不同房间进行。也可能是端粒酶没有彻底灭活，建议用RNase酶解法或酶解+热灭活法。
3. 实验阴性对照管的实验结果中出现TRAP条带，可能是引物二聚体，可采取两步法TRAP，并且将DNA模板加入到70℃预热的PCR Mix3.0中再进行PCR。
4. 实验结果不好时，可以直接采取2步法，先做端粒酶延伸和灭活，然后再纯化DNA，用纯化的DNA做PCR。此法需要用户自备dNTP。