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BTN111207 动物线粒体纯化试剂盒
发布时间：2017-10-01 11:36 | 点击次数：332
动物线粒体纯化试剂盒说明书
产品编号：BTN111207
规格：5T（A型）/5T（B型）
产品及特点：
线粒体是非常重要的细胞器，它不但跟很多人类疾病相关，而且还是母系遗传研究的重要材料。对线粒体进行遗传研究和生化研究都需要纯化线粒体。本产品可用于纯化动物细胞线粒体的试剂盒。它具有下列特点：
1. 即开即用，用户不需要自己配制各种溶液，优化各种条件。
2. 有粗提和精提两个选择，但是精提需要超速离心机。粗提所得线粒体可以直接用于蛋白分析（SDS-PAGE、Western Blot、ELISA等）、蛋白组分析和线粒体DNA纯化。精提线粒体可以用于偶联分析和体外线粒体蛋白合成等实验。
3. 本产品一次可以处理约2×108个培养细胞，30mg培养细胞（相当于15瓶150mm培养细胞）可以纯化到到0.5-1.5 mg线粒体。
4. 本产品适用于各种动物悬浮培养细胞和贴壁培养细胞，不能用于动物实体组织。
5. 提供线粒体染液，可以在操作中随时监测纯化过程中线粒体的完整性。
规格及成分：
A型（粗提型）
B型（精提型）
保存条件：
常温运输和保存, 保存期限一年。
自备试剂：
PBS缓冲液。
使用方法：
注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或冷室进行，所要用到的溶液和离心管都必须预先冷却，否则线粒体容易破裂。
一：准备工作（此步骤同柱式动物线粒体DNA提取试剂盒中线粒体提取步骤）。未用完的下列溶液需要-20℃保存，否则容易长菌。下次使用前务必让沉淀溶解并摇晃均匀。
1. 将溶液A和溶液B放冰上预冷待用。
2. 配制1.7M高比重溶液（仅限BTN111207B精提型试剂盒，BTN111207A粗提型试剂盒不需要配制此溶液）：36克蔗糖用溶液B溶解并定溶到60mL，冰上预冷待用。
3. 配制1.0M低比重溶液，BTN111207A粗提型试剂盒需要100mL，配制方法是将34克蔗糖用溶液B溶解并定溶到100mL，冰上预冷待用。111207B粗提型试剂盒需要150mL，配制方法是将51克蔗糖用溶液B溶解并定溶到150mL，冰上预冷待用。
4. 配制线粒体重悬液，BTN111207A粗提型试剂盒需要200mL，配制方法是将150 mL溶液B和50 mL 1.0M低比重溶液混合；BTN111207B精提型试剂盒需要300mL，配制方法是将225 mL溶液B和75 mL 1.0M低比重溶液混合，即得300mL 线粒体重悬液，冰上预冷待用。
二：线粒体粗提（此步骤同柱式动物线粒体DNA提取试剂盒中线粒体提取步骤）
5. 如果提取材料是单层细胞，先用60 mL 自备的PBS缓冲液洗涤2×108个培养的单层细胞，共洗涤2次。然后用塑料刮匙刮下细胞，重悬在60 mL PBS缓冲液中。如果是悬浮细胞，则1000g 4℃离心10分钟收集2×108个细胞，再用60 mL PBS缓冲液洗涤2次，最后将细胞重悬在60 mL PBS缓冲液中。
6. 用平甩转子（swinging-bucket rotor）离心机1000 g 4℃离心10分钟，吸弃上清，保留细胞沉淀。
7. 加入5倍体积(以细胞沉淀的体积为基数)的预冷的溶液A，轻柔重悬细胞。
8. 冰上放置4-5分钟。注意：冰浴时间不要超过5分钟。
9. 如果是成纤维细胞，由于其难以裂解，可将细胞重悬液在-80℃放置20-30分钟后再化冻，然后进入下步操作。如果不是成纤维细胞，则直接进入下步操作。
10. 将细胞重悬液体转移到预冷的Dounce玻璃匀浆器中（工作体积为10-15 mL，间隙为0.12 mm，最好是玻璃材质，否则线粒体产率会降低）匀浆适当次数。细胞株不同，其最适匀浆次数不同，一般需要40次-60次左右。匀浆是线粒体纯化最关键的步骤，故匀浆前最好先通过预实验确定最适匀浆次数，方法是每匀浆5-10次后，取2-3 μL匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整细胞数量降低到20%以下为佳。
11. 加入1/3体积的、预冷的1.0 M低比重溶液，轻柔混匀。
12. 用平甩转子离心机4℃ 1000 g离心10分钟。沉淀含残留完整细胞、细胞碎片和细胞核，上清液含线粒体。
13. 转移上清液到离心管中，冰上放置。在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴50μL左右上清液到载玻片上，再滴入50 μL詹纳斯染液绿B染色液20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
14. 用固定角度转子（fixed-angle rotor）离心机4℃ 15000 g离心15分钟，弃上清，所得棕黑色沉淀即为粗提线粒体沉淀。
15. 用10 mL线粒体重悬液重悬线粒体，4℃ 15000 g离心15分钟，弃上清。
16. 重复上步一次。
17. 最后用适量的线粒体重悬液重悬线粒体，可用于各种后续实验（本试剂盒不提供相关试剂），如果用于下面的精提操作，则用10mL线粒体重悬液重悬。
三：线粒体精提（需要超速离心机）
18. 在跟超速离心机匹配的50 mL的离心管中，加入10 mL预冷的高比重溶液，再在上面加上10 mL预冷的低比重溶液，最后再加上10 mL线粒体粗提液。
19. 70000g 4℃离心40分钟，线粒体将位于高比重溶液和低比重溶液之间区域。
20. 小心用广口吸管吸出线粒体到新的离心管中，加入等体积的线粒体重悬液。
21. 用平甩转子（swinging-bucket rotor）离心机1000 g 4℃离心10分钟，吸弃上清，保留线粒体沉淀。
22. 用10 mL线粒体重悬液重悬线粒体，在平甩转子离心机上4℃ 1000 g离心10分钟，吸弃上清，保留线粒体沉淀。
23. 再重复上步一次。
24. 最后用适量线粒体重悬液重悬线粒体，得到线粒体精提液。可以直接用于Lowry法蛋白浓度测定，也可以用于其他后续实验。
产品编号：BTN111207
规格：5T（A型）/5T（B型）
产品及特点：
线粒体是非常重要的细胞器，它不但跟很多人类疾病相关，而且还是母系遗传研究的重要材料。对线粒体进行遗传研究和生化研究都需要纯化线粒体。本产品可用于纯化动物细胞线粒体的试剂盒。它具有下列特点：
1. 即开即用，用户不需要自己配制各种溶液，优化各种条件。
2. 有粗提和精提两个选择，但是精提需要超速离心机。粗提所得线粒体可以直接用于蛋白分析（SDS-PAGE、Western Blot、ELISA等）、蛋白组分析和线粒体DNA纯化。精提线粒体可以用于偶联分析和体外线粒体蛋白合成等实验。
3. 本产品一次可以处理约2×108个培养细胞，30mg培养细胞（相当于15瓶150mm培养细胞）可以纯化到到0.5-1.5 mg线粒体。
4. 本产品适用于各种动物悬浮培养细胞和贴壁培养细胞，不能用于动物实体组织。
5. 提供线粒体染液，可以在操作中随时监测纯化过程中线粒体的完整性。
规格及成分：
A型（粗提型）
| 成分 | 5T（A型） |
| 溶液A | 50ml |
| 溶液B | 250ml |
| 蔗糖 | 80g |
| 詹纳斯绿B染色液（0.2%） | 1ml |
| 成分 | 5T（B型） |
| 溶液A | 50ml |
| 溶液B | 250ml×2 |
| 蔗糖 | 100g |
| 詹纳斯绿B染色液（0.2%） | 1ml |
| 说明书 | 1份 |
常温运输和保存, 保存期限一年。
自备试剂：
PBS缓冲液。
使用方法：
注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或冷室进行，所要用到的溶液和离心管都必须预先冷却，否则线粒体容易破裂。
一：准备工作（此步骤同柱式动物线粒体DNA提取试剂盒中线粒体提取步骤）。未用完的下列溶液需要-20℃保存，否则容易长菌。下次使用前务必让沉淀溶解并摇晃均匀。
1. 将溶液A和溶液B放冰上预冷待用。
2. 配制1.7M高比重溶液（仅限BTN111207B精提型试剂盒，BTN111207A粗提型试剂盒不需要配制此溶液）：36克蔗糖用溶液B溶解并定溶到60mL，冰上预冷待用。
3. 配制1.0M低比重溶液，BTN111207A粗提型试剂盒需要100mL，配制方法是将34克蔗糖用溶液B溶解并定溶到100mL，冰上预冷待用。111207B粗提型试剂盒需要150mL，配制方法是将51克蔗糖用溶液B溶解并定溶到150mL，冰上预冷待用。
4. 配制线粒体重悬液，BTN111207A粗提型试剂盒需要200mL，配制方法是将150 mL溶液B和50 mL 1.0M低比重溶液混合；BTN111207B精提型试剂盒需要300mL，配制方法是将225 mL溶液B和75 mL 1.0M低比重溶液混合，即得300mL 线粒体重悬液，冰上预冷待用。
二：线粒体粗提（此步骤同柱式动物线粒体DNA提取试剂盒中线粒体提取步骤）
5. 如果提取材料是单层细胞，先用60 mL 自备的PBS缓冲液洗涤2×108个培养的单层细胞，共洗涤2次。然后用塑料刮匙刮下细胞，重悬在60 mL PBS缓冲液中。如果是悬浮细胞，则1000g 4℃离心10分钟收集2×108个细胞，再用60 mL PBS缓冲液洗涤2次，最后将细胞重悬在60 mL PBS缓冲液中。
6. 用平甩转子（swinging-bucket rotor）离心机1000 g 4℃离心10分钟，吸弃上清，保留细胞沉淀。
7. 加入5倍体积(以细胞沉淀的体积为基数)的预冷的溶液A，轻柔重悬细胞。
8. 冰上放置4-5分钟。注意：冰浴时间不要超过5分钟。
9. 如果是成纤维细胞，由于其难以裂解，可将细胞重悬液在-80℃放置20-30分钟后再化冻，然后进入下步操作。如果不是成纤维细胞，则直接进入下步操作。
10. 将细胞重悬液体转移到预冷的Dounce玻璃匀浆器中（工作体积为10-15 mL，间隙为0.12 mm，最好是玻璃材质，否则线粒体产率会降低）匀浆适当次数。细胞株不同，其最适匀浆次数不同，一般需要40次-60次左右。匀浆是线粒体纯化最关键的步骤，故匀浆前最好先通过预实验确定最适匀浆次数，方法是每匀浆5-10次后，取2-3 μL匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整细胞数量降低到20%以下为佳。
11. 加入1/3体积的、预冷的1.0 M低比重溶液，轻柔混匀。
12. 用平甩转子离心机4℃ 1000 g离心10分钟。沉淀含残留完整细胞、细胞碎片和细胞核，上清液含线粒体。
13. 转移上清液到离心管中，冰上放置。在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴50μL左右上清液到载玻片上，再滴入50 μL詹纳斯染液绿B染色液20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
14. 用固定角度转子（fixed-angle rotor）离心机4℃ 15000 g离心15分钟，弃上清，所得棕黑色沉淀即为粗提线粒体沉淀。
15. 用10 mL线粒体重悬液重悬线粒体，4℃ 15000 g离心15分钟，弃上清。
16. 重复上步一次。
17. 最后用适量的线粒体重悬液重悬线粒体，可用于各种后续实验（本试剂盒不提供相关试剂），如果用于下面的精提操作，则用10mL线粒体重悬液重悬。
三：线粒体精提（需要超速离心机）
18. 在跟超速离心机匹配的50 mL的离心管中，加入10 mL预冷的高比重溶液，再在上面加上10 mL预冷的低比重溶液，最后再加上10 mL线粒体粗提液。
19. 70000g 4℃离心40分钟，线粒体将位于高比重溶液和低比重溶液之间区域。
20. 小心用广口吸管吸出线粒体到新的离心管中，加入等体积的线粒体重悬液。
21. 用平甩转子（swinging-bucket rotor）离心机1000 g 4℃离心10分钟，吸弃上清，保留线粒体沉淀。
22. 用10 mL线粒体重悬液重悬线粒体，在平甩转子离心机上4℃ 1000 g离心10分钟，吸弃上清，保留线粒体沉淀。
23. 再重复上步一次。
24. 最后用适量线粒体重悬液重悬线粒体，得到线粒体精提液。可以直接用于Lowry法蛋白浓度测定，也可以用于其他后续实验。