BTN120201 超敏化学发光(HRP)检测试剂盒

超敏化学发光(HRP)检测试剂盒说明书
产品编号：BTN120201
规格：25mL/250mL
产品及特点：
本产品用于免疫印迹实验（Western）或核酸印迹实验（Southern 或Northern）中辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体的超灵敏检测。该产品基于新一代增强型化学发光（ECL）底物研制而成，在HRP 的催化下发生化学反应而发光，可用于检测固定在印迹膜上的蛋白质和核酸等生物大分子。它具有下列特点：
1. 即开即用，非常方便。
2. 高灵敏度，能够检测pg 级别的抗原。
3. 改良配方，发光信号强烈持久。
4. 可以使用照相技术（X-光胶片曝光）或者其他成像方法（如荧光或化学发光成像仪）进行检测。
5. 25 mL 包装足够250cm2 印迹膜显色，250 mL 包装足够2500cm2 印迹膜显色。
6. 可用于Western、Southern、Northern 等印迹杂交检测。
规格及成分：

成分	25ml	250ml
溶液A	12.5ml	125ml
溶液B	12.5ml	125ml
说明书	1份	1份

保存条件：
常温运输，4℃保存，有效期一年。
自备试剂：
印迹杂交相关试剂。
使用方法：

• 按常规方法进行Western、Southern、Northern 等印迹杂交实验，直到与HRP 标记的二抗孵育结束。

注意：
A：为获得最佳实验结果，请务必优化关键的印迹实验参数，包括检测样品的用量、一抗稀释度、HRP标记的二抗的稀释度、杂交膜及封闭试剂的选择。一抗的推荐用量为100ng/mL -500 ng/mL， HRP 标记的二抗的推荐用量为10 ng/mL-50ng/mL。
B：由于奶粉中含有动物源性的生物素，故在使用亲和素/生物素系统时，不能使用含奶粉的封闭液。
C：建议在封闭液及所有抗体稀释液中加入高质量的吐温-20（终浓度为0.05%），以减少抗体与印迹膜的非特异性结合。
D：由于叠氮钠是HRP 的抑制剂，故所有相关缓冲液中应避免使用叠氮钠。
E：不能裸手接触印迹膜以避免蛋白污染。
2. 印迹膜与HRP 标记的二抗孵育完毕后，用自备的洗膜液充分洗涤核酸或蛋白印迹膜，在最后一次洗涤的数分钟时间内，完成下步的ECL工作液配制。
3. 根据需要量，将溶液A 和溶液B 按照1：1 的比例等体积混合，所得溶液即为ECL 工作液。一张8 cm×6 cm 的印迹膜一般需要1-5 mL 的ECL工作液。注意：配制好的ECL 工作液如果用锡箔纸包好（避光），可在室温下放臵8小时，保存时需避免阳光或其他强光照射。正常实验室灯光短时间照射不影响ECL 工作液的使用。
4. 弃去洗膜液，将ECL 工作液滴加在印迹膜的蛋白或核酸吸附面（也是抗体吸附面）上。
注意：一定要确保ECL工作液覆盖整个印迹膜。
5. 室温孵育5 分钟。
6. 去掉ECL 工作液，将印迹膜臵于两层干净的保鲜膜之间。注意：一定要避免保鲜膜与印迹膜吸附面之间产生气泡。
7. 如果用X-光胶片曝光，则在暗室内将X-光胶片和印迹膜的吸附面接触，曝光，洗片按常规操作进行；如果用或使用荧光成像仪或化学发光成像仪，则按照仪器说明书进行检测。
疑难解答：
问题1：胶片反相（即信号条带为白色，背景为黑色）、印迹膜上出现棕色或黄色条带、暗室中看到强烈发光、发光信号持续时间过短。
原因：可能是系统中HRP 过量，需要稀释HRP 标记的二抗至少10 倍以上。
问题2：信号较弱或者无信号
原因：可能是发光反应系统中 HRP 过多，消耗底物过快，引起信号迅速降低。
需要稀释HRP 标记物至少10 倍以上；也可能是抗原/抗体量不够，需要增加抗原/抗体使用量；还可能使蛋白转移率低，需要优化转移系统。
问题3：高背景
原因：可能是系统中HRP 过量，需要稀释HRP 标记的二抗至少10 倍以上。
也可能是封闭不足或封闭试剂选择不当，需要优化封闭步骤；还可能是冲洗不充分或曝光过度或抗原/抗体浓度过高。
问题4：蛋白条带为点状原因：可能是蛋白转移失败或胶片与印迹膜之间有气泡，曝光前需去除印迹膜吸附面和保鲜膜之间的气泡。
问题5：出现非特异条带原因：如果背景高，则可能是系统中HRP 过多，需要稀释HRP 标记的抗体。如果背景干净，则可能是一抗用量过多，需要进一步稀释一抗；也可能是SDS 导致抗体的非特异结合，故在实验过程中应避免使用SDS。