BTN120310 T7 RNA聚合酶

T7 RNA聚合酶说明书
产品编号：BTN120310
规格：1000U
产品及特点：
T7 RNA聚合酶（T7 RNA Polymerase）是一种高度特异识别T7启动子序列的DNA依赖的5'→3' RNA聚合酶，它可以催化单链或双链DNA T7 启动子下游NTP的掺入，合成与T7启动子下游的模板DNA互补的RNA。本产品具体下列特点：
1. 对于T7启动子有高度的特异性，用于体外RNA（含小RNA）的合成。
2. 能识别修饰的NTP（生物素标记、地gao辛标记、荧光素标记的NTP），可用于标记探针。
3. 所得RNA可用于下列后续实验：核酸杂交、基因组DNA序列分析、核糖核酸酶保护测定(RNaseprotection assay)、反义RNA合成，体外翻译，RNA剪接、RNA二级结构分析、RNA-蛋白质相互作用、核酸扩增、siRNA、miRNA等小RNA。
规格及成分：

成分	规格
T7 RNA聚合酶 (20 U/μL)	50μl
5×反应缓冲液	250μl
说明书	1份

保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
使用方法：
一、制备DNA模板（本试剂盒不含所需试剂，此处信息仅供参考）
PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。一是必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。二是需要转录的DNA序列的上游必须有T7启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将T7启动子序列（5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3’）加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T7启动子的载体，并且克隆位点必须位于T7启动子下游。三是需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3’突出。如果是3’突出（比如选择了Pst I来线性化质粒），则最好用T4 DNA聚合酶修平。四是必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此来判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。
 
 
 
二、体外转录反应（本试剂盒不含除酶和反应液之外的相关试剂）
1. 在一个RNase-free 的塑料离心管中，在室温下（不是在4℃下）按次序加入下列成分：

成分	加入量	备注
DNA模板		如果使用质粒DNA,必须反复酚-氯仿抽提去除残留的RNase,然后再乙醇沉淀质粒DNA
PCR片段	50ng左右
质粒DNA	1μg左右
RNase Inhibitor
5×反应缓冲液	4μl	需室温时使用
NTP（2.5 mM each）	4μl
T7 RNA聚合酶	0.5-1μL
RNase-free水	补水到20μL

注：此为20μL反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记RNA探针，则需要订购NTP分开的试剂盒。如果需要得到加帽RNA，则需要加入自备的加帽修饰核苷酸。
2. 37℃保温1-2小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热10分钟灭活T7 RNA聚合酶。
4. 取1-3 μL电泳检测转录效果。一般1 ug DNA可以合成 5-10 ug的RNA。
5. 得到的RNA可以放-80℃保存。
三、如果需要去除DNA模板（仅产品不提供所需试剂）
1. 在体外转录体系中加入1 μL自备的 RNase-free DNase （3-5 U/μL）。
2. 37℃保温15-30分钟。
3. 补水到100 μL。
4. 用自备的等体积（100 μL）的Tris饱和酚-氯仿抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。
5. 加200 μL微量核酸沉淀剂（用前需要摇晃混匀），振荡后15000 rpm离心3-5分钟，弃上清。
6. 加入1 mL 75%乙醇，震荡10秒后15000 rpm离心3-5分钟，弃上清。
7. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。晾干，所得沉淀即体外转录所得的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。