BTN120402 PCR专用LIC克隆套装

PCR专用LIC克隆套装说明书
产品编号：BTN120402
规格：1μg
产品及特点：
LIC就是不依赖于连接的克隆技术(Ligation-Independent Cloning),它是继限制性内切酶切/连接酶克隆方法后出现的第二代DNA克隆技术,其原理如下：
 
 
 
它效率高,尤其适用于大规模分子克隆。本产品就是基于LIC原理开发的即用型载体,它具有下列特点：
1. 操作简单,一管式一步反应,只需加入插入片段即可,客户不需要购买任何额外的酶。
2. 时间短,整个过程只要15分钟。
3. 高效,比常用的AT克隆效率更高,阳性率接近于100%。
4. 克隆方向和位置精准和可控,适合表达型克隆工作。
5. 便于自动化,适合高通量克隆。
6. 适用于长片段克隆。
 
规格及成分：

成分	规格
LIC载体(50μg/μL)	1μg
溶液A	10μl
溶液B	150μl
阳性对照插入片段	8μl
说明书	1份

保存条件：
-20℃运输及保存,有效期一年。
自备试剂：
引物。
使用方法：
一. PCR引物设计,合成和PCR反应
1. 按常规方法设计PCR引物,只是必须在一条引物5‘端再加上GGCGGCCGCGGTAC序列,在另一条引物5’端加上GGCGCCGGCGGTAC序列。此序列决定克隆的方向,如果不在乎方向,可以随机组合。
2. 所用引物最好为HPLC纯化获得。注意：如果购买本公司产品,免费合成LIC引物一对。
3. 按常规的方法进行PCR,最好使用高保真DNA聚合酶。
4. 按常规的胶回收的方法回收PCR片段。注意：必须去除残余的dNTP和PCR引物,否则会极大降低LIC效率。
5. 对PCR片段电泳定量,即电泳后通过肉眼比较PCR片段和DNA Marker的相对强度,通过DNA Marker条带的浓度(一般商品化的DNA Marker每条带的浓度都是已知的)推测出PCR片段的浓度。
二. PCR片段与载体退火
1. 在纯化的2μL PCR产物中加入0.4μL溶液A、2μL载体(100ng)以及5μL溶液B,混合。
注意：PCR产物跟载体的摩尔数比例最好是1：1。
2. 室温放置5分钟。注意：保温时间长短很关键,不要轻易延长或缩短。
3. 在PCR仪器上按75℃ 10分钟,然后放冰上或-20℃待用。
三. 转化
1. 按常规方法进行转化。
2. 按菌落PCR方法筛选,可选用我公司的菌落PCR试剂盒(BTN50901)。
进行快速筛选,需要T7和SP6 RNA聚合酶启动子引物。