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BTN120415 终点显色法内毒素定量试剂盒
发布时间：2017-10-01 11:40 | 点击次数：820
终点显色法内毒素定量试剂盒说明书
产品编号：BTN120415
规格：32T
产品及特点：
本试剂盒用于体外细菌内毒素的定量检测，禁止以任何途径进入机体。
检测原理如下：鲎试剂为鲎科动物东方鲎（TAL）的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品, 鲎试剂中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在适宜的条件下(温度，pH 值及无干扰物质），细菌内毒素激活C因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax=405nm）。在一定时间内，pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量样品的内毒素浓度。同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545nm），避免了样品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。它具有下列特点：
1. 该试剂盒仅用于体外细菌内毒素的定量检测，严禁试剂以任何途径进入机体。
2. 接触试剂及样品的所有器皿必须是除热原的。实验过程应防止微生物的污染。该说明书中的除热原指内毒素浓度小于0.005 EU/ml。玻璃器皿可经250℃干烤至少60分钟去除热原。
3. 待测样品的pH值应在6.0–8.0之间，若超出此范围，需用除热原的缓冲液、0.1M氢氧化钠或0.1M盐酸调节。
4. 当样品中可能存在鲎实验的干扰物质时，须进行干扰实验。
规格及成分：
保存条件：
常温运输，4℃避光保存，有效期两年。
自备试剂：
旋涡混合仪、移液器、多道移液器、试管架、恒温水浴箱（37±1℃）、分光光度计。
使用方法：
1. 样品的贮存与预处理
1.1 样品中可能含有β－葡聚糖（β－葡聚糖会产生G因子旁路反应，干扰内毒素检测），需选用特异性鲎试剂。
1.2 若样品为一些抗菌素如头孢类抗菌素和磺胺制剂会对偶氮染色剂产生偶联反应而干扰偶氮化显色，需要选用不含偶氮化试剂的试剂盒。
1.3 若样品的本底吸光度值大于0.5,必须对样品进行稀释后再检测。
1.4 若样品颜色较深(例如溶血)，或在酸性条件下颜色加深(例如一些组织培养介质),必须设置样品空白管以扣除样品自身的颜色本底。样品空白管不加入鲎试剂，以等体积鲎试剂的溶剂(该处为细菌内毒素检查用水)
代替。其余操作同样品管。
2. 实验操作
2.1 细菌内毒素标准溶液配制
标准曲线所采用的内毒素浓度可以为0.01, 0.025, 0.05, 0.1EU/mL 或0.1, 0.25, 0.5,1.0EU/mL。稀释方法如下（以0.1, 0.25, 0.5, 1.0 EU/mL为例）：取细菌内毒素标准品1支，按细菌内毒素标准品使用说明书稀释为10EU/mL的内毒素溶液，再稀释为1.0EU/mL的内毒素溶液，以1.0EU/mL的内毒素溶液为母液按下表稀释成0.1,0.25,0.5,1.0 EU/mL的浓度梯度。配制好的内毒素标准溶液应在4小时内用完。
表1 内毒素标准溶液配制
2.2 阴性对照为细菌内毒素检查用水。
2.3 鲎试剂、显色基质、偶氮化试剂等的溶解
鲎试剂：按标示量加细菌内毒素检查用水于鲎试剂中，轻轻振摇使鲎试剂完全溶解, 注意不要用旋涡混匀剧烈振摇。溶解的鲎试剂应在10分钟内用完。显色基质：按标示量加细菌内毒素检查用水于显色基质中，轻轻振摇使显色基质完全溶解。显色基质溶液可在无污染的条件下于4 ºC贮存8小时以内。
偶氮化试剂1：按标示量加反应终止剂盐酸于偶氮化试剂1中，
偶氮化试剂2：按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂2中，
偶氮化试剂3：按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂3中，
偶氮化试剂溶液可于4ºC贮存1周。
2.4 实验操作
取无热原试管，加入100 μL细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液，或待测样品。再加入100 μL鲎试剂溶液，混匀，37ºC温育T1分钟。温育结束，加入100 μL显色基质溶液，混匀，37ºC温育T2分钟。温育结束，加入500 μL偶氮化试剂1溶液，混匀，加入500μL偶氮化试剂2溶液，混匀加入500 μL偶氮化试剂3溶液，混匀，静置5分钟，于545nm波长处读取吸光度值。(见表２)
表 2 实验操作
本试剂盒建议反应时间T1及T2如下：
内毒素标准范围（EU/mL）为0.01-0.1，T1为60分钟，T2为6分钟；
内毒素标准范围（EU/mL）为0.1-1，T1为10分钟，T2为6分钟。
3. 数据处理
建立标准曲线：Y = b X + a，其中 Y为545nm处吸光度值，X为内毒素的浓度，b为直线斜率，a为Y轴截距。
当实验数据同时满足如下三个条件时实验才有效：
1.标准曲线的相关系数r≥0.980，
2.标准曲线最低点的Y值大于阴性对照的Y值，
3.待测样品平行管的平均值在标准曲线的区间内。
待测样品的干扰实验
待测样品的干扰实验详见《中华人民共和国药典》2010细菌内毒素检查法》的“光度测定法干扰实验”。当鲎试剂、待测样品的来源、配方、生产工艺改变或实验环境中发生了任何有可能影响实验结果的变化时，须进行干扰实验,步骤如下:
1、选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm），作为待测样品干扰实验中添加的内毒素浓度，配制含λm内毒素的待测样品阳性对照，测量出该溶液的内毒素浓度,称为Cs；
2、测量出未添加外源内毒素的待测样品溶液内毒素浓度,称为Ct；
3、计算该实验条件下的回收率R＝（Cs–Ct）/λm×100%
4、当R在50%～200%之间，则认为在此实验条件下待测样品溶液不存在干扰作用。
5、当R在50%～200%之外，需对待测样品进行系列稀释(稀释倍数不得超过最大有效 稀释倍数MVD)或进行其它处理消除干扰,每一稀释溶液都重复步骤1-3,直到内毒素的回收率R在50%～200%之间。选择回收率R最接近100%的稀释倍数进行内毒素检测。
附件
细菌内毒素标准品使用说明
本品为白色疏松海绵状固体，系参照中国药品生物制品检定所的细菌内毒素工作标准品标定的大肠杆菌内毒素冻干品，供鲎实验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和各种阳性对照。
用法：
1. 溶解：加入细菌内毒素检查用水（BET水）1 mL, 复溶后置涡旋混匀器上混匀15 min。
2. 稀释：将上述内毒素溶液进一步用细菌内毒素检查用水稀释成各个不同浓度2λ、λ、0.5λ、0.52λ等浓度。
注意事项：
1. 本品为一次性使用。仅供体外鲎实验检测，禁止用于注射、口服等。
2. 实验所用的器皿需经过处理，以除去可能存在的外源性内毒素，可以经250℃干烤至少60分钟处理，也可以采用其他确保不干扰细菌内毒素检测的适宜方法处理。实验操作过程中应该防止微生物的污染。
3. 稀释的内毒素溶液静置时间超过10分钟，用前需要在涡旋混匀器上剧烈混匀1分钟，放置4小时以上的内毒素溶液应丢弃。
产品编号：BTN120415
规格：32T
产品及特点：
本试剂盒用于体外细菌内毒素的定量检测，禁止以任何途径进入机体。
检测原理如下：鲎试剂为鲎科动物东方鲎（TAL）的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品, 鲎试剂中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在适宜的条件下(温度，pH 值及无干扰物质），细菌内毒素激活C因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax=405nm）。在一定时间内，pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量样品的内毒素浓度。同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545nm），避免了样品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。它具有下列特点：
1. 该试剂盒仅用于体外细菌内毒素的定量检测，严禁试剂以任何途径进入机体。
2. 接触试剂及样品的所有器皿必须是除热原的。实验过程应防止微生物的污染。该说明书中的除热原指内毒素浓度小于0.005 EU/ml。玻璃器皿可经250℃干烤至少60分钟去除热原。
3. 待测样品的pH值应在6.0–8.0之间，若超出此范围，需用除热原的缓冲液、0.1M氢氧化钠或0.1M盐酸调节。
4. 当样品中可能存在鲎实验的干扰物质时，须进行干扰实验。
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| 细菌内毒素标准品 | 2支 |
| 鲎试剂 | 2支×1.7 mL |
| 显色基质 | 2支×1.7 mL |
| 偶氮化试剂1 | 2支×10 mL |
| 偶氮化试剂2 | 2支×10 mL |
| 偶氮化试剂3 | 2支×10 mL |
| HCl (反应终止剂) | 50ml |
| 细菌内毒素检查用水 | 50ml×2瓶 |
| 除热原试管，10×75mm | 10×5支 |
| 除热原吸头，1000VL | 10×4支 |
| 除热原吸头，200VL | 10×5支 |
| 说明书 | 1份 |
常温运输，4℃避光保存，有效期两年。
自备试剂：
旋涡混合仪、移液器、多道移液器、试管架、恒温水浴箱（37±1℃）、分光光度计。
使用方法：
1. 样品的贮存与预处理
1.1 样品中可能含有β－葡聚糖（β－葡聚糖会产生G因子旁路反应，干扰内毒素检测），需选用特异性鲎试剂。
1.2 若样品为一些抗菌素如头孢类抗菌素和磺胺制剂会对偶氮染色剂产生偶联反应而干扰偶氮化显色，需要选用不含偶氮化试剂的试剂盒。
1.3 若样品的本底吸光度值大于0.5,必须对样品进行稀释后再检测。
1.4 若样品颜色较深(例如溶血)，或在酸性条件下颜色加深(例如一些组织培养介质),必须设置样品空白管以扣除样品自身的颜色本底。样品空白管不加入鲎试剂，以等体积鲎试剂的溶剂(该处为细菌内毒素检查用水)
代替。其余操作同样品管。
2. 实验操作
2.1 细菌内毒素标准溶液配制
标准曲线所采用的内毒素浓度可以为0.01, 0.025, 0.05, 0.1EU/mL 或0.1, 0.25, 0.5,1.0EU/mL。稀释方法如下（以0.1, 0.25, 0.5, 1.0 EU/mL为例）：取细菌内毒素标准品1支，按细菌内毒素标准品使用说明书稀释为10EU/mL的内毒素溶液，再稀释为1.0EU/mL的内毒素溶液，以1.0EU/mL的内毒素溶液为母液按下表稀释成0.1,0.25,0.5,1.0 EU/mL的浓度梯度。配制好的内毒素标准溶液应在4小时内用完。
表1 内毒素标准溶液配制
| 内毒素浓度(EU/mL) | 1 | 0.5 | 0.25 | 0.1 |
| 加细菌内毒素检查用水(mL) | 0 | 0.5 | 0.75 | 0.9 |
| 加1EU/ml内毒素溶液(mL) | 1 | 0.5 | 0.25 | 0.1 |
2.3 鲎试剂、显色基质、偶氮化试剂等的溶解
鲎试剂：按标示量加细菌内毒素检查用水于鲎试剂中，轻轻振摇使鲎试剂完全溶解, 注意不要用旋涡混匀剧烈振摇。溶解的鲎试剂应在10分钟内用完。显色基质：按标示量加细菌内毒素检查用水于显色基质中，轻轻振摇使显色基质完全溶解。显色基质溶液可在无污染的条件下于4 ºC贮存8小时以内。
偶氮化试剂1：按标示量加反应终止剂盐酸于偶氮化试剂1中，
偶氮化试剂2：按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂2中，
偶氮化试剂3：按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂3中，
偶氮化试剂溶液可于4ºC贮存1周。
2.4 实验操作
取无热原试管，加入100 μL细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液，或待测样品。再加入100 μL鲎试剂溶液，混匀，37ºC温育T1分钟。温育结束，加入100 μL显色基质溶液，混匀，37ºC温育T2分钟。温育结束，加入500 μL偶氮化试剂1溶液，混匀，加入500μL偶氮化试剂2溶液，混匀加入500 μL偶氮化试剂3溶液，混匀，静置5分钟，于545nm波长处读取吸光度值。(见表２)
表 2 实验操作
| 阴性对照 | 内毒素标准 | 样品 | |
| 加细菌内毒素检查用水(μL) | 100 | - | - |
| 加内毒素标准溶液(μL) | - | 100 | - |
| 加待测样品(μL) | - | - | 100 |
| 加鲎试剂(μL) | 100 | 100 | 100 |
| 混匀，37ºC温育T1分钟 | |||
| 加显色基质溶液(μL) | 100 | 100 | 100 |
| 混匀，37ºC温育T2分钟 | |||
| 加偶氮化试剂1溶液(μL) | 500 | 500 | 500 |
| 混匀，加偶氮化试剂2溶液(μL) | 500 | 500 | 500 |
| 混匀，加偶氮化试剂3溶液(μL) | 500 | 500 | 500 |
| 混匀,静置5分钟，于λ545nm测OD值 | |||
内毒素标准范围（EU/mL）为0.01-0.1，T1为60分钟，T2为6分钟；
内毒素标准范围（EU/mL）为0.1-1，T1为10分钟，T2为6分钟。
3. 数据处理
建立标准曲线：Y = b X + a，其中 Y为545nm处吸光度值，X为内毒素的浓度，b为直线斜率，a为Y轴截距。
当实验数据同时满足如下三个条件时实验才有效：
1.标准曲线的相关系数r≥0.980，
2.标准曲线最低点的Y值大于阴性对照的Y值，
3.待测样品平行管的平均值在标准曲线的区间内。
待测样品的干扰实验
待测样品的干扰实验详见《中华人民共和国药典》2010细菌内毒素检查法》的“光度测定法干扰实验”。当鲎试剂、待测样品的来源、配方、生产工艺改变或实验环境中发生了任何有可能影响实验结果的变化时，须进行干扰实验,步骤如下:
1、选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm），作为待测样品干扰实验中添加的内毒素浓度，配制含λm内毒素的待测样品阳性对照，测量出该溶液的内毒素浓度,称为Cs；
2、测量出未添加外源内毒素的待测样品溶液内毒素浓度,称为Ct；
3、计算该实验条件下的回收率R＝（Cs–Ct）/λm×100%
4、当R在50%～200%之间，则认为在此实验条件下待测样品溶液不存在干扰作用。
5、当R在50%～200%之外，需对待测样品进行系列稀释(稀释倍数不得超过最大有效 稀释倍数MVD)或进行其它处理消除干扰,每一稀释溶液都重复步骤1-3,直到内毒素的回收率R在50%～200%之间。选择回收率R最接近100%的稀释倍数进行内毒素检测。
附件
细菌内毒素标准品使用说明
本品为白色疏松海绵状固体，系参照中国药品生物制品检定所的细菌内毒素工作标准品标定的大肠杆菌内毒素冻干品，供鲎实验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和各种阳性对照。
用法：
1. 溶解：加入细菌内毒素检查用水（BET水）1 mL, 复溶后置涡旋混匀器上混匀15 min。
2. 稀释：将上述内毒素溶液进一步用细菌内毒素检查用水稀释成各个不同浓度2λ、λ、0.5λ、0.52λ等浓度。
注意事项：
1. 本品为一次性使用。仅供体外鲎实验检测，禁止用于注射、口服等。
2. 实验所用的器皿需经过处理，以除去可能存在的外源性内毒素，可以经250℃干烤至少60分钟处理，也可以采用其他确保不干扰细菌内毒素检测的适宜方法处理。实验操作过程中应该防止微生物的污染。
3. 稀释的内毒素溶液静置时间超过10分钟，用前需要在涡旋混匀器上剧烈混匀1分钟，放置4小时以上的内毒素溶液应丢弃。