Southern级动物DNA提取试剂盒说明书
产品编号：BTN120655
规格：5T
产品及特点：
本产品用于从动物培养细胞，动物实体组织和抗凝血液（新鲜或冷冻）中提取高分子量的Southern 级的基因组DNA。它具有下列特点：
1. 即开即用，本产品足够5次中量提取（即每次处理0.5g组织），50 次微量提取（即每次处理50-100 mg组织），。
2. DNA 纯净，OD260/280 值在1.8 左右；完整性好，长度在100-200 Kb，适用于Southern杂交、基因文库构建等对DNA 长度要求较高的试验，也可用于PCR 和酶切等实验。
3. 产量高，每克组织DNA产率为500 μg，5×10⁷个培养细胞可以得到200 μg DNA，20 mL 新鲜血液可以得到250 μg DNA。足够多次Southern 杂交使用。
规格及成分：

成分	规格
裂解液	50ml
蛋白酶K 溶液（10mg/mL）	0.5ml
Tris 饱和酚	100ml
氯仿：异戊醇混和液	100ml
TE 缓冲液	50ml
说明书	1份

保存条件：
常温运输，4℃保存(但蛋白酶K 需要低温运输，-20℃保存)，有效期一年。
自备试剂：
PBS、氯仿、75%乙醇、无水乙醇。
使用方法：
注意：任何时候都不能剧烈震荡、过度离心、或过度干燥DNA，否则将发生断裂、难溶解等现象。
1. 根据材料的不同按下面的方法处理细胞：
a) 贴壁细胞：用橡胶刮子刮下5×10⁷ -5×10⁸个贴壁细胞并转移到10-15 mL 塑料离心管中，1500 g 4℃离心10 分钟收集细胞，用10 mL 自备的PBS 洗涤细胞2 次，最后将细胞悬浮于PBS 中使细胞的浓度为5×10⁷个/mL。取1 mL 加入10 mL 裂解液，轻柔颠倒混匀后放37℃水浴一小时。
b) 悬浮细胞：1500 g 4℃离心10 分钟收集5×10⁷ 个-5×10⁸个细胞，用10 mL 自备的PBS 洗涤细胞2 次，最后将细胞悬浮于PBS中使细胞的浓度为5×10⁷个/mL。取1 mL 加入10 mL 裂解液，轻柔颠倒混匀后放37℃水浴一小时。
c) 实体组织：把0.5 g 新鲜的组织样品（约5×10⁸个细胞）迅速剪切成不超过1立方厘米的小块放液氮中冻存，取出后放预冷的研钵中加液氮研磨成粉，待液氮挥发后，把组织粉末转移到10 mL 裂解液中，让细粉在液面缓慢扩散，然后摇晃使组织粉末浸入裂解液中，最后将溶液转移到10-15 mL 塑料离心管中，轻柔颠倒混匀后放37℃水浴一小时。注意：实体组织中肝脏和脾脏的DNase 活性较高，其DNA 极易断裂，故最好不要选用这两种材料，而是选用肺脏、肌肉、肾脏等材料。
d) 新鲜血液：1500 g 4℃离心20 mL 新鲜抗凝血液（最好使用ACD抗凝，约含2×10⁷ 个有核细胞）15 分钟，去掉血浆，用吸管小心吸出淡黄色的一层并转移到一个新的离心管中，再次离心并取淡黄色层，在淡黄色层中加3 mL 裂解液，37℃水浴一小时。
e) 冷冻血液：室温水浴融化15 mL 冷冻血液（最好使用ACD 抗凝，约含1.5×10⁷ 个有核细胞），加入一倍体积的自备PBS 溶液稀释样品，3500 g 室温离心15 分钟，去掉血浆，加入3 mL 裂解液，轻柔颠倒混匀后放37℃水浴一小时。
2. 在裂解样品中加入100 μL 蛋白酶K 溶液，轻柔颠倒混匀后放50℃水浴3-13 小时。期间需要每隔半小时轻柔颠倒数次混匀。
3. 加10 mL 的Tris 饱和酚，轻柔颠倒10 分钟混匀（混合液将呈乳浊状）。不要剧烈震荡，否则DNA 将断裂。
4. 5000 g 室温离心15 分钟，用粗吸管（直径不小于3 mm）将粘稠的上清（含DNA）转移到新离心管中。可以将蓝抢头剪断一截用来转移上清，下同。也可以将下层有机相吸走。
5. 在上清中加入10 mL 酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混和液，颠倒5 分钟混匀，5000 g 室温离心5 分钟，用粗吸管（直径不小于3 mm）将粘稠的上清（含DNA）转移到新离心管中。
6. 在上清中加入0.1 倍体积的3M 乙酸钠（pH5.2）和2 倍体积的无水乙醇，轻柔颠倒混匀数次即可见絮状的DNA 沉淀出现。在DNA 还没变成白色（表示有SDS 等沉淀附集在DNA 上）前用玻璃棒或枪头将DNA挑出。
7. 将DNA 浸入6 mL 75%乙醇中30 秒，再浸入6 mL 无水乙醇中30 秒。
8. 用枪头将DNA 从玻璃棒上挂到一个干净的10mL 或15mL 塑料离心管中，室温放置30-60 分钟让乙醇挥发，然后加入5-10 TE 缓冲液，在DNA 沉淀中加入1mL TE，65℃加热10 分钟以促进DNA 溶解和灭活残留的DNase，然后4℃放置过夜以让DNA彻底溶解。如果过夜溶解后DNA溶液浑浊，可以850g离心5 分钟，取上清（DNA 溶液）。
9. 取1-2μL 在0.7%琼脂糖胶上电泳以检查DNA的完整性和浓度（需要用浓度确定的lambda DNA/HindIII 作为电泳Marker），否则不能用于后续的酶切。也可测OD260和OD280计算产率，但此法不是非常准确。
10. 将DNA 稀释到0.1μg/μL后可立即使用，也可以在4℃放置几周，但不建议在-20℃或更低的温度放置（DNA 会断裂）。长期保存最好溶入100%乙醇中后放-20℃保存。
三：Southern 级DNA的酶切（本试剂盒不提供所需试剂。在酶切高浓度DNA 时，酶能否进入DNA 内部非常关键，所以请严格按下面步骤操作）
11. 计算DNA 酶切量与拷贝数。1 pg DNA=978 Million bp=0.978Billion bp。人基因组为3Bbp，Southern 杂交至少需要10μg。
12. 设置200 μL 的酶切反应：加入10μg DNA，10 μL 10×酶切缓冲液，加水到190 μL，轻柔混匀后4℃放数小时让DNA 松涨，期间混匀几次。
13. 按5U/μg DNA 的比例加入所选择的内切酶，先在4℃混匀数分钟，再放到37℃酶切30 分钟。此步有利于酶打开DNA。
14. 按5U/μg DNA 的比例再加入所选择的内切酶，混匀后37℃ 8-12 小时（为避免水分蒸发，最好加100μL 石蜡油或在带热盖的PCR 仪中进行）。
15. 取2μL 酶切物电泳检测是否酶切完全，如果酶切不完全则需要分析原因。
16. 加20 μL 3M 乙酸钠（pH5.2）和400 μL 无水乙醇，混匀后离心10 分钟沉淀DNA，再用1mL 75%乙醇洗涤一次，干甩数秒后吸干上清。
17. 立即加入50 μL TE 过夜溶解DNA 沉淀。
18. 56℃加热2-3 分以打断DNA 片段黏性末端间的结合，加上样液后全部上样到不含EB的、0.7%的琼脂糖胶上，按小于1V/cm 的电压电泳12小时，结束后EB 染色拍照后用于转膜。注意：需加1ng 阳性质粒或标记的lambda/Hind III。如果不立即电泳，可存放于4℃数周。
疑难解答：
Q：所得DNA 电泳呈弥散状？
A: 可能是材料采集后耽误太久才处理，也可能是液氮研磨前或研磨时已经融化，使DNA 被内源核酸酶降解。