血液线粒体和核DNA双提试剂盒说明书
产品编号：BTN120810
规格：25T
产品及特点：
本产品是在本公司血液DNAout 产品基础上开发的、专门用于从新鲜或冷冻的哺乳动物抗凝全血中同时提取细胞核DNA 和线粒体DNA 的试剂。它具有下列特点：
1. 一份样品可以同时得到细胞核DNA 和线粒体DNA，节约宝贵的实验材料。
2. DNA产率高。细胞核DNA 产率一般为30-50 μg/mL 新鲜血液，线粒体DNA产率约为1 μg/mL 新鲜血液。陈旧血液DNA 产率差别较大。
3. DNA 纯净，OD260/OD280 在1.8-2.0 之间，可直接用于PCR、酶切、杂交等实验。
4. 适用于哺乳动物血液，不适用于其他动物血液。
5. 所用试剂安全无毒，健康环保。
规格及成分：

成分	规格
红细胞裂解液D 型	250mL
溶液A	25ml
溶液B	2ml
溶液C	5ml
DNA 洗脱液2.0	10ml
说明书	1份

保存条件：
常温运输和保存, 保存期限一年。
自备试剂：
无水乙醇，75%乙醇。
使用方法：
一：白细胞核和线粒体的分离
1. 将3 mL 用EDTA 抗凝管收集的新鲜血液转移到一个干净的15 mL 塑料离心管中。注意：最好使用新鲜血液。对于陈旧血液，由于冻凝过程中冰晶已经对细胞核膜和线粒体膜产生损伤，所以DNA 得率会大大减少，具体减少多少根据冻凝时间长短不同而不同。
2. 向血液中加入等体积（3 mL）的D 型红细胞裂解液；轻柔颠倒数次混匀，室温静置10 分钟以裂解红细胞和白细胞的细胞膜，直至溶液变成清澈的红色。注意：D 型红细胞裂解液一旦打开后，非常容易污染细菌，未用完的部分最好-20℃保存，下次使用前，要溶解后充分摇匀。
3. 室温下1000 g 离心10 分钟沉淀白细胞核。
4. 转移上清（含线粒体）到新的15 mL 塑料离心管中，注意不要触及白细胞核沉淀。
5. 在白细胞核沉淀中加入3 mL D 型红细胞裂解液。轻柔颠倒数次混匀后，室温下1000 g 离心10 分钟以沉淀白细胞核。
6. 转移上清（含线粒体）到第4 步所得的、已经含有上清的15 mL 塑料离心管中。
将白细胞核沉淀放置冰上，和即将准备好的线粒体一起用于DNA 提取，也可以放置在-20℃待用。
7. 将汇集的含线粒体的上清于4℃下15,000g 离心30 分钟。
8. 小心移弃上清，小心将线粒体沉淀重悬在1 mL D 型红细胞裂解液中，然后转移到1.5 mL 塑料离心管中，15000 g 离心5 分钟，移弃上清得到线粒体沉淀。
9. 用1 mL D 型红细胞裂解液洗涤线粒体2 次（每次先重悬线粒体，再15000 g离心5 分钟得沉淀）。
10. 所得线粒体可以直接用于DNA 提取，也可放置在-20℃待用。
二：DNA 的提取（下面步骤为白细胞核DNA 提取和线粒体DNA 提取通用）
11. 在白细胞沉淀或线粒体沉淀中加入0.5 mL 溶液A，用移液枪吹打数次混匀后再加入75 uL 溶液B，混匀后于55℃温育10 分钟。注意：溶液将成浑浊状。
12. 再加入0.2 mL 溶液C 充分颠倒混匀。
13. 在4℃下13000g 离心20 分钟后，将上清（含DNA）转入一新的1.5 mL 塑料离心管中。
14. 加入两倍体积的自备无水乙醇充分震荡混匀后，室温13000 g 离心5 分钟，去尽上清。
15. 加入1 mL 75%乙醇，充分混匀后室温13000g 离心5 分钟，去尽上清。
16. 重复上步一次。
17. 短暂离心，去尽残留溶液（此步十分重要，不要省略）。
18. 短暂晾干半分钟，加入适量DNA 洗脱液2.0 溶解DNA（对细胞核DNA，可加入500 uL DNA 洗脱液2.0，对线粒体DNA，可加入50 uL DNA 洗脱液2.0）。
19. 65℃保温15 分钟以便彻底溶解DNA 沉淀。溶解后的DNA 可以立即用于后续的OD 检测、酶切、PCR 或其他实验，也可以放置在-20℃长期保存。