非同位素探针杂交试剂盒说明书
产品编号：BTN121114
规格：5T(A)/5T(B)
产品及特点：
本产品是专门用于生物素和DIG 标记的非同位素探针印迹膜杂交的试剂盒。
本产品具有下列特点：
1. 即开即用，提供杂交和洗膜所需的溶液，用户不需要单独准备。A 型适用于常规的DNA 和RNA探针，B 型适用于Oligo探针。
2. 使用手册为生物素探针杂交专门优化，免去用户自己摸索条件。
3. 足够5次大小为13×20cm 的Southern 或Northern 印迹膜杂交。
4. 可用于DIG 和生物素标记的DNA、RNA 和Oligo探针兼容。
5. 采用精心优化的低温杂交液，使DNA-RNA 或RNA-RNA 等一般较高温度的杂交实验能在较低温度进行（降低RNA 的降解）。
6. 即可用于硝酸纤维素膜，也可用于中性尼龙膜，尤其适用于非同位素标记的探针的Southern 和Northern 杂交。
7. 杂交的印迹膜可以用ECL 检测、显色检测和放射自显影检测。
规格及成分：

成分	规格
超级杂交液（含甲酰胺）	200mL（A型提供）
超级杂交液（Oligo探针）	200mL（B型提供）
通用洗膜液成分一	25mL
通用洗膜液成分二	250mL×2
20×SSPE 溶液	250mL
说明书	1份

保存条件：
常温运输及保存，有效期一年。
自备试剂：
离子水、非同位素标记的探针、生物素或DIG 检测试剂。
使用方法：
注意：任何时候都只能使用钝头镊子或和玻璃棒。相关溶液的用量都是针对大小为100cm 的印迹膜，如果所用印迹膜大小不同，请按比例调整用量。
一：准备相关溶液
1. 准备探针：如果是双链探针，加入前需先在95℃变性15分钟，再迅速放冰上冷却30分钟备下步使用（也可以加入等体积的自备的0.2N NaOH，室温放置10分钟后直接加入到杂交液中）。如果是单链探针(DNA 或RNA)或Oligo探针，则不需要变性处理。注意：单链探针效果远好于双链探针（后者杂交时两条链之间也能相互杂交，竞争性抑制了探针跟靶片段的杂交）。探针的长度最好在400-800bp 之间，否则易产生高背景。
2. 准备杂交液：一般100cm² 印迹膜需要2.5-5mL 超级杂交液。用前在超级杂交液（含甲酰胺）中加入终浓度为5-25 ng/mL 的DNA探针或终浓度为100 ng/mL 的RNA探针；对Oligo探针杂交，则在超级杂交液（Oligo探针）中加入终浓度为0.1-0.2 pmol/mL 的、对含多个标记的Oligo探针或终浓度为1-10pmol/mL 的、含单个标记的Oligo探针。
3. 用去离子水稀释100mL 20×SSPE 溶液到3×SSPE 溶液。
二：Southern 杂交
4. 用3×SSPE 溶液湿润Southern 印迹膜后，将膜转移到杂交袋、杂交盒或杂交管中。注意：结合核酸的一面必须朝外。
5. 如果是尼龙膜，则加入自备的2×SSPE 和1% SDS 混合液40℃处理3-4小时。如果是NC 膜，则跳过此步。
6. 加入20mL 不含探针的超级杂交液（含甲酰胺）。如果将使用DNA探针，则42℃预杂交4小时，如果将使用RNA探针，则55℃预杂交4小时。
7. 预杂交结束后，收集预杂交液放-20℃长期保存（可重复使用5-7次）。
8. 加入在第2 步准备好的、2.5-5mL 含探针的杂交液。如果探针为DNA 则42℃杂交15-24小时，如果探针为RNA 则55℃杂交15-24小时。
注意：杂交时间跟靶片段拷贝数和探针浓度密切相关，此处的杂交时间是针对单拷贝基因，探针浓度见第2 步。如果是高拷贝模板（电泳上样量为1-2pg 的质粒样品）可以只杂交1-2小时；如果是低拷贝模板（基因组DNA 中的单基因）并且使用的双链探针，最多可杂交8小时（超过8小时后，由于双链探针两条单链之间可高效杂交，杂交液中基本没有可跟印迹膜上靶分子杂交的游离单链探针了）；如果是低拷贝模板并且使用单链探针，则可杂交24小时。如果将探针的终浓度提高到100-200 ng/mL，即使对检测单基因的杂交也只需要4-6小时。
9. 杂交结束后，收集杂交液并放-20℃备用（可以放置1 年以上并重复使用15次，但每次使用前都需要再补加相当于首次加入量1/10 的探针）。
10. 洗膜后将膜在3×SSPE 中浸泡3分钟后即可用于后续检测。
三：Northern 杂交
11. 用自备的3×SSPE 湿润Northern 印迹膜后，将其转移到杂交袋、杂交盒或杂交管中。注意：结合核酸的一面必须朝外。
12. 加入20 mL 不含探针的超级杂交液（含甲酰胺）。如果将使用DNA探针则50℃预杂交8-16小时，如果将使用RNA探针则68℃预杂交4小时。
13. 预杂交结束后，收集预杂交液放-20℃长期保存（可以重复使用5-7次）。
14. 加入在第2 步准备好的、2.5-5mL含探针的杂交液。如果探针为DNA则50℃杂交5-24小时，如果探针为RNA 则68℃杂交过夜（12小时）。
15. 杂交结束后，收集杂交液并放-20℃备用（可以放置1 年以上并重复多次使用，但每次使用前需要再补加入相当于首次加入量1/10的探针）。
四：洗膜

• 选择洗膜条件。本试剂盒的杂交严谨度(或专一性)主要通过采用不同洗膜液体盐离子浓度来控制，具体使用哪种洗膜液最佳，需要根据杂交最后结果来确定。建议首次使用本试剂盒时先选择中严谨度，再根据杂交结果调整。一旦确定最适洗膜条件，则一次性大量制备洗膜液以减少实验误差。

严谨度	洗膜液	洗膜条件
低	洗膜液A	室温洗涤3分钟，2次
	洗膜液B	37℃洗涤3分钟，1次
中	洗膜液B	37℃洗涤3分钟，2次
	洗膜液C	37℃洗涤3分钟，1次
高	洗膜液B	37℃洗涤3分钟，1次
	洗膜液D	50℃洗涤15分钟，2次对（对NC 膜） 65℃洗涤15分钟，2次对（对尼龙膜）

• 配制洗膜液：

洗膜液	配方（1 升的量）
洗膜液A	成分一 5mL，成分二 100 mL，去离子水895 mL
洗膜液B	成分一 5mL，成分二 50 mL，去离子水945 mL
洗膜液C	成分一 5mL，成分二 10 mL，去离子水985 mL
洗膜液D	成分一 5mL，成分二 9 mL，去离子水986 mL

• 洗膜：将印迹膜用镊子转移到在有盖的干净塑料盒中进行，核酸吸附面朝上，加入至少50 mL 洗膜液，轻柔摇晃以使印迹膜保持漂动。洗膜时间和严谨度按上表进行。
• 洗膜后将印迹膜在3×SSPE 中浸泡3分钟后即可用于后续检测。

附件：Oligo探针的Southern 和Northern 杂交Oligo探针杂交不同之处在于必须使用超级杂交液（Oligo探针），杂交温度一般是Tm-5℃，预杂交时间是1-4小时，杂交时间是5-16小时，洗膜条件是洗膜液A 室温洗膜2次，每次5分钟，洗膜液C 52-68℃洗膜2次。