CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒说明书
产品编号：BTN121205
规格：5ml
产品及特点：
本CCK-8试剂盒是基于WTS-8的第二代细胞增殖及毒性检测产品，主要成分为水溶性四唑盐WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐，WST-8为一种MTT类似物，在电子耦合试剂1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成橙黄色水溶性的甲臜 (formazan)。生成的甲臜量与活细胞数量成线性相关。
与第一代试剂盒相比，它具有下列特点：
1. 溶液稳定，对细胞无毒性，可直接同步加入到细胞样品中长时间孵育，可以多次测定选取最佳测定时间。
2. 灵敏度高，实验的灵敏度比其它如MTT, XTT或 MTS高，操作简便、快捷，实验结果重复性好。
3. 水溶性，免去后续的溶解步骤。
4. 不需要换液，尤其适合于悬浮细胞。
5. 安全无毒，不会对操作人员身体造成危害。
6. 可以广泛应用于生物活性因子的活性检测、药物的筛选、细胞增殖检测、细胞毒性。
规格及成分：

成分	规格
CCK-8	5×1ml
说明书	1份

保存条件：
常温运输和4 ℃干燥避光保存，有效期一年。
自备试剂：
低速离心机 、酶标仪（450nm 波长）、平板摇床、微量移液器、96 孔板。
使用方法：
一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时测定细胞具体数量时）
1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。
2. 按比例（例如：1/2 比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5 个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。
3. 接种后培养 2-4小时使细胞贴壁，然后加 CCK 试剂培养一定时间后测定 OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X 轴），OD 值为纵坐标（Y 轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK 后的培养时间）。
二、细胞活性检测
1． 在96 孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板在培养箱中预培养24小时（ 37℃,5% CO2）。
2． 每孔加入10 μL 的CCK 溶液。
3. 将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。
4. 用酶标仪测定在450nm 处的吸光度。
5. 如果暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M 的HCl 溶液或者 1%w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会发生变化。
三、细胞增殖-毒性检测
1． 在96 孔板中配置 100 μL 的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24 小时（ 37℃，5% CO2）。
2. 向培养板中加入10 μL 不同浓度的待测物质。
3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24 或 48 小时）。
4. 向每孔加入 10μL CCK 溶液。
5. 将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。
6. 用酶标仪测定在450nm 处的吸光度。
7. 如果暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10 μL 0.1M 的HCl 溶液或者 1%w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会发生变化。
注意事项：
1. 如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK 之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。如果药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基， 直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
2. 用酶标仪检测前请确保孔内没有气泡，否则会干扰测定。
3. 建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK 试剂后的培养时间。
4. 有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入 CCK 试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，会干扰OD 值读数。
5. 白细胞可能需要培养较长时间。
6. 当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1,000 个/孔 (100 μL培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2,500 个/孔(100 μL 培养基)。如果要使用24 孔板或 6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10%加入 CCK 溶液。
7. 如果没有 450nm 的滤光片，可以使用吸光度在 430-490 nm 之间的滤光片，但是 450nm 滤光片的检测灵敏度最高。
8. 培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
结果分析：
细胞活力* （％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0 加药）-A（空白）] ×100
A（加药）：具有细胞、CCK 溶液和药物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培养基和CCK 溶液而没有细胞的孔的吸光度
A（0 加药）：具有细胞、CCK 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力