一管式双链cDNA合成试剂盒说明书
产品编号：BTN130308
规格：10T
产品及特点：
本产品是用于一管式双链cDNA合成的试剂盒。cDNA第一链合成的原理是以OligodT为通用引物的、MMLV催化的逆转录反应。其原理如下：
 
cDNA 第二链合成的原理是用RNase H使RNA-DNA杂合链中的RNA产生切口，再用DNA Polymerase I通过切口平移(nick translation)反应进行RNA链取代合成cDNA第二链，其原理图如下：
 
 
本产品具有下列特点：
1. 即开即用，含有合成两条cDNA链的所有试剂。
2. 适用于含poly rA 的RNA，对不含poly rA 的RNA（如细菌RNA），不能使用本试剂盒制备ds cDNA。
3. 一管式进行，第一链cDNA合成后不需要任何处理，直接进入第二链的合成。
4. 所得双链cDNA 可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA文库构建、抑制性差减杂交等。
5. 本试剂盒足够10次80μL体系的双链cDNA合成反应。
6. 如果需要合成全长cDNA，最好选用SMART全长cDNA双链合成试剂盒。
 
规格及成分：

成分	规格
Oligo dT 引物	10μl
cDNA 第一链合成缓冲液	40μl
MMLV 逆转录酶（200U/μL）	10μl
5×cDNA 第二链合成缓冲液	160μl
20×cDNA 第二链合成酶混合液	40μl
T4 DNA 聚合酶	20μl
0.2 M EDTA 溶液	40μl
超纯水	1ml
说明书	1份

保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
mRNA 提取试剂盒
使用方法：
一：mRNA 的制备
本试剂盒不提供mRNA 提取试剂，用户需自备相关试剂。
二：双链cDNA的合成

• 在一个干净的塑料离心管中，按下表设置cDNA合成反应：

成分	用量
自备mRNA样品	4 μL（0.5-2μg）
Oligo dT引物	1μL
70℃ 2 分钟后室温放置2 分钟，短暂离心
cDNA 第一链合成缓冲液	4μL
MMLV 逆转录酶	1μL
轻柔吹打混匀后42℃保温90 分钟合成第一链cDNA
超纯水	48μL
cDNA 第二链合成缓冲液	16μL
cDNA 第二链合成酶混合液	4μL
轻柔吹打混匀后，短暂离心，16℃保温2 小时
自备的T4 DNA 聚合酶	2μL
轻柔吹打混匀后，16℃继续保温30 分钟
0.2M EDTA 溶液	4μL

注：如果不需要将双链cDNA平末端化，则可以跳过T4 DNA聚合酶处理步骤。
2. 电泳5μL检测cDNA质量。如果cDNA 在0.5-10Kb的范围内呈模糊一片，则cDNA合格。如果没看见cDNA 或有其他异常，需查找原因后再继续。
3. 所得cDNA可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA 文库构建、抑制性差减杂交等实验。