Protein A琼脂糖说明书
产品编号：BTN130418
规格：1mL
产品及特点：
Protein A 能特异性地与抗体的Fc 区结合，广泛应用于抗体纯化、免疫化学等领域，本产品以琼脂糖凝胶为基质，Protein A 共价到4% Agarose beads。本产品为进口分装，它具有下列特点：
1. 主要用于免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）或免疫共沉淀（Co-IP），也可以用于抗体的纯化。
2. 适合于免疫沉淀多数哺乳动物的IgG Fc 段结合，包括mouse IgG2a, IgG2b,IgA, rabbit IgG, 以及human IgG1, IgG2 和IgG4。
3. 2 mL 本产品中共含有约2.5 mg 重组的Protein A，共可以结合约17 mg human IgG。
4. 配制在TBS 溶液中，2 mL 中共含有0.5 mL Agarose beads。
5. 如果用于常规的免疫沉淀，可以免疫沉淀100 次。
规格及成分：

成分	规格
Protein A琼脂糖	1ml
说明书	1份

保存条件：
常温运输，4℃保存，请勿冻存本产品，有效期一年。
自备试剂：
蛋白样品、PBS等。
使用方法：
1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：
1) 蛋白样品的准备：
A. 对于10 厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS 洗涤一次，然后加入500 微升至2 毫升细胞裂解液裂解细胞。
B. 对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。
C. 对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS 洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。 注： 详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10 厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
2) 去除非特异性结合(可选做)：
A. 取200 微升至1 毫升蛋白样品，蛋白量约为200 微克至1 毫克，加入约1 微克和免疫沉淀时使用的IgG 种属相同的普通IgG 和20 微升充分重悬的Protein A Agarose，4℃缓慢摇动30 分钟至2 小时。
B. 2500rpm(约1000g)离心5 分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。
注： 所谓种属相同的IgG 是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG 可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG 类型的抗体。通过和normal IgG 和Protein A Agarose 的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
3) 免疫沉淀：
A. 加入0.2-2 微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。
B. 再加入20 微升充分重悬的Protein A Agarose，4℃缓慢摇动1-3 个小时。(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein A Agarose 的量调整为40 微升。)
C. 2500rpm(约1000g)离心5 分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A Agarose。
D. 用准备蛋白样品时的裂解液或PBS 洗涤沉淀5 次，裂解液或PBS 的用量每次为0.5-1 毫升。洗涤时离心条件和吸除 上清的要求同上面的步骤C。
E. 完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40 微升1×SDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex 重悬沉淀，瞬时高速离心 把样品离心至管底。
F. 100℃或沸水浴处理3-5 分钟，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20℃保存。
2. 免疫共沉淀：
参考免疫沉淀的方法进行，但免疫共沉淀(Co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品，但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。
3. 抗体纯化：
1) 准备工作：
A. 用0.45 微米或0.2 微米孔径的滤膜过滤所用的溶液。
B. 所有的溶液必须用超声等方法脱气(degas)。
C. 选择适当的纯化柱，用适当量的Protein A Agarose 装填纯化柱。
D. 用10-20 倍柱体积的TBS 洗涤并平衡纯化柱，流速可以用恒流泵控制为1mL/min。如无恒流泵，也可以完全依靠 重力洗涤并平衡纯化柱。
2) 抗体纯化：
A. 把含有待纯化的抗体上样到纯化柱。
B. 待纯化的抗体过柱后，用10-20 倍柱体积的TBS 洗涤，以去除未结合和非特异性结合的蛋白。洗涤是否完全可以 通过测定280 nm 的吸光度进行确定。
C. 洗涤完后，用10 mL 50 mM glycine， pH 2.7 作为洗脱液，洗脱结合的抗体。某些抗体和Protein A 的结合能力很强，在pH 2.7 时洗脱效果不太理想，可以使用50 mM glycine，pH 1.9 作为洗脱液。分管收集洗脱下的抗体，根据蛋白浓度或后续的检测效果确定洗脱峰在哪几个收集管中。
3) 纯化柱的再生：
A. 用10-20 倍柱体积的TBS 洗涤纯化柱，使纯化柱达到中性的pH。
B. 用TBS 来保存再生的纯化柱。
注意事项：
1. 请勿冻存本产品。
2. 使用前一定要充分重悬，即充分颠倒若干次使产品混合均匀。
3. 从蛋白样品收集开始，所有步骤中蛋白样品都必须在4℃或冰上操作。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。