甲基化PCR 2.0试剂盒说明书
产品编号：BTN130428
规格：150T
产品及特点：
亚硫酸氢盐修饰DNA时要求DNA 必须在单链状态，反应还必须在低温进行，常规的修饰试剂盒由于是在液相进行，要在低温下让DNA 不相互复性而保持单链状态非常棘手，所以常规修饰试剂盒的修饰效率一般都不高。此外，常规方法要切换反应液，
有多次沉淀步骤，使得DNA 的回收率一般都不超过50%。为克服这些缺点，本公司开发出了此升级产品，它具有下列特点：
1．用包埋的样品进行所有操作，免去所有沉淀和纯化步骤，极大简化了操作。
2．免去了DNA 提取过程，所需实验材料比常规方法更少，最少几个细胞都可以，极大地节约了宝贵材料，尤其适用于珍稀材料。
3．包埋处理后，DNA 在整个操作过程中都处于最适于修饰的单链状态，极大提高了修饰效率。
4．DNA 包埋于包埋块中，切换反应液非常方便，而且DNA 不会丢失，所以最终回收率都在90%以上。
5．适用于实体材料、悬浮细胞和纯化好的DNA 样品。
6．本试剂盒提供的甲基化修饰试剂盒足够制备150多个10μL包埋块（如果用纯化好的DNA）或25个10μL包埋块（如果用悬浮细胞）；本试剂盒提供的PCR试剂盒足够180次100μL体系的PCR反应。
规格及成分：
成分一：甲基化修饰试剂盒(BTN130301)

成分	规格
包埋液	1.5ml
分子生物学级石蜡油	25ml
包埋块裂解液	12.5ml
蛋白酶K溶液（10mg/mL）	150μl
溶液A	30ml
溶液B 成分一	2.3 g×5 棕色瓶
溶液B 成分二	110 mg×5 棕色管
TE 缓冲液，pH 8.0	125ml
说明书	1份

注: 包埋液用1.5 mL 旋盖离心管包装，溶液B 成分一用5 mL 棕色瓶包装，溶液B 成分二用1.5 mL 旋盖棕色管包装。
 
 
成分二：即用型PCR 3.0（BTN90805）

成分	规格
PCR MagicMix 3.0	9ml
专用染料	360μl
说明书	1份

保存条件：
常温运输及保存, 保存期一年。但Proteinase K 和即用型PCR Mix3.0 需要低温运输，-20℃保存。
自备试剂：
超纯水。
使用方法：
一：准备试剂
1. 在装有2.3g溶液B成分一干粉的瓶中加入3.9 mL水和0.9 mL溶液A，摇晃溶解得到4.8mL 溶液B 成分一。在装有110mg 溶液B 成分二干粉的离心管中加入1 mL 50℃预热的超纯水，摇晃溶解，得到溶液B成分二。将0.6 mL溶液B成分二加入到4.8 mL溶液B成分一中，得到5.4 mL溶液B，冰上放置待用。未用完的溶液B 下次不得再使用。
2. 每次实验前，将装有1.5 mL 包埋液离心管在沸水浴上放置数分钟直到变成溶液，然后放80℃待用。
二、对微量组织材料（如果材料足够，可先纯化DNA，再按第三方案进行）
1. 用常规的胰酶消化法处理动物实体组织或培养细胞，得到浓度不超过60细胞/μL 的单细胞PBS 悬液。如果实验材料已经是单细胞悬浮液（如卵细胞），则PBS 洗涤后直接离心沉淀，再重悬在PBS 中（浓度不超过60细胞/μL）。注：本试剂盒不含本步所需相关试剂。
2. 在一个2 mL 离心管中加入3μL 细胞悬液，再迅速滴加7μL在80℃预热的包埋液。注：不需要吹打混匀以免混合液在抢头里面凝固。
3. 加入500μL分子生物学级石蜡油，将离心管在沸冰浴中放置20 分钟。
4. 将离心管转移到冰上放置30分钟，低温下包埋液和细胞混合液将凝固成10μL的包埋块。
5. 加入500μL 包埋块裂解液和5μL Proteinase K溶液，37℃保温过夜。
加入的溶液比重都比石蜡油大，将会自动沉降到石蜡油下层，不需离心。
6. 吸弃包埋块之外的所有溶液（包括石蜡油），用1mL TE 缓冲液室温浸泡包埋块2次，每次15 分钟。此步可去除残留包埋块裂解液。
7. 酶切包埋块中的DNA：选定不识别PCR靶片段的内切酶（本试剂不提供该相关试剂），再用100μL选定内切酶的1×缓冲室温液浸泡包埋块15分钟，吸弃缓冲液后再加入100μL 选定内切酶的1×缓冲液和50U选定的内切酶，37℃保温2小时。
8. 吸弃酶切反应液，再加入500μL 新鲜配制的处理液A（配制方法：100μL溶液A+400μL 超纯水）室温放置15分钟，重复此步一次。此时DNA 将呈单链。
9. 吸弃处理液A，用1 mL新鲜配制的处理液B（配制方法：50μL溶液A+950μL超纯水）室温浸泡包埋块5分钟。
10. 吸弃处理液B，加入750μL石蜡油，然后沸水浴20-30秒，使DNA单链彻底彼此分开。
11. 奖离心管转移到冰上放置30分钟使包埋块重新凝固。
12. 在离心管中加入1mL预冷的溶液B，溶液B将自动沉降到石蜡油下层。
继续在冰上放置30分钟。此步用于修饰单链的DNA。
13. 将离心管转移到50℃放置3.5小时。
14. 吸弃溶液B，用1mL TE缓冲液常温洗涤包埋块2次，每次15分钟。
15. 吸弃TE 缓冲液，用500μL新鲜配制的处理液C（50μL溶液A+450μL超纯水）常温洗涤包埋块2次，每次15分钟。
16. 吸弃处理液C，用1mL TE 缓冲液常温洗涤包埋块3次，每次10分钟.
17. 吸弃TE缓冲液，所得包埋块可以在4℃保存数月待用，也可以用超纯水洗涤两次（每次15分钟）后直接用做100μL体系甲基化PCR的模板。
三、对纯化好的DNA
18. 选用不识别PCR 靶片段的合适内切酶酶切纯化的基因组DNA（本试剂不提供所需试剂），总体积不超过20μL，基因组DNA 不超过700ng。
19. 酶切结束后，沸水浴5-10 分钟灭活内切酶并变性DNA。
20. 冰上放置并短暂离心数秒后，再加入4μL溶液A，50℃保温15分钟。
21. 迅速加入50μL在80℃预热的包埋液，用手指快速弹击管底混匀溶液并继续放80℃待用。不要吹打混匀以避免包埋液在移液枪头中凝固。
22. 在一个新的、2 mL离心管中，加入1mL预冷的溶液B，再加上750mL石蜡油，并将离心管放冰上预冷。
23. 迅速取80℃保温的混合液10μL，用在空中滴加的方式加到上步准备的预冷的离心管中，滴加的混合液遇冷将迅速在石蜡油中形成包埋块并自动沉入管底。注意：不要将枪头浸入到预冷的溶液中，否则包埋液将迅
速在枪头内凝固。如果包埋块没有沉到管底，可以用枪头将其拨到石蜡层下面的液相中。
24. 再重复上步操作，共可以得到7 个包埋块（约含100ng DNA）。
25. 将离心管（含7个包埋块）继续放冰上30分钟进行修饰。
26. 后续操作同第13-17 步。
四、甲基化专一性PCR（由于包埋块可能会抑制PCR，所以最好使用100μL体系的PCR进行甲基化检查，如果效果不好，建议使用巢式PCR）
27. 在一干净的PCR 管中，加入下列成分（冰上操作）：

成份	样品管	对照管
PCR MagicMix 3.0	50μl	50μl
DNA 包埋块（修饰后DNA）	1 块（约含100ng DNA）	无
对照DNA（修饰前DNA）	无	100ng
自备MSP 引物F	25 pmol	无
自备MSP 引物R	25 pmol	无
自备非甲基化PCR 引物F	无	25 pmol
自备非甲基化PCR 引物R	无	25 pmol
补水到	100μl	100μl

28. 将混合物混匀，放入PCR仪中进行热启动PCR，结束后取5-10μL PCR产品直接进行琼脂糖电泳。