磁珠动物DNA提取试剂盒说明书
产品编号：BTN130433
规格：50T
产品及特点：
本产品是利用磁珠的方法提取动物组织基因组DNA 的试剂盒，所含生物磁珠是一种新型的功能化固体载体，其表面包被有活性基团，可以与多种生物活性物质发生偶联，兼具有液体的流动性和固体磁性材料等特点，在外磁场的作用下可以定向移动和集中，当撤去外磁场后，稍加振荡或抽吸又可均匀分散于液体中，从而使固液相的分离变的十分快捷方便，通过简单的洗脱可以得到纯度很高的目的物质。其操作流程如下:
 
本试剂盒所含磁珠微粒可以特异地吸附DNA，通过洗涤，去除DNA以外的RNA、蛋白质等杂质，从而达到分离纯化DNA的目的。它具有下列特点:
1. 操作快速简捷，一般可在60分钟内完成。适用于动物组织、血液、和干血点等样品。
2. 所得 DNA 纯度高，OD260/OD280一般达 1.7-1.9。
3. DNA 得率高，产率可以达 8-30 ug/10mg（组织）。得到的DNA长度可达 20kb- 50kb，可直接用于 PCR、Southern-blot 和各种酶切反应。
4. 性价比高，质量与进口试剂盒相当，但价格更便宜。
5. 本产品既适用于手工提取又能用于工作站提取。
规格及成分：

成分	规格
溶液A	12ml
溶液B	20ml
溶液C	25ml
溶液D	20ml
溶液E	15ml
磁珠悬浮液G	2×1ml
Proteinase K	1ml
说明书	1份

保存条件：
常温运输和保存，有效期一年。
自备试剂：
样品、异丙醇、乙醇、RNaseA（100mg/mL）等。
使用方法：
使用前请先在溶液 C 和溶液 D 中加入无水乙醇，加入体积请按照瓶上的标签
一、手工操作步骤：
1. 取动物组织 10-50 mg，尽量剪成小块，加入200μL 溶液A(组织消化液)和20μL Proteinase K，使用电动匀浆机研磨约10 s 至组织研磨充分。
1) 对于匀浆充分的样本可以省去 65℃消化的时间；
2) 对于有肉眼可见组织块的样本，建议 65℃消化30min 至消化完全；
3) 对于鼠尾样本，56℃消化过夜。
注意：样本消化完成后，如果有组织碎片，建议12,000 rpm 离心1min去除残留杂质。
注意：如果需要去除RNA，加入4μL RNase A 室温放置10min（自备）
2. 加入 300μL 溶液B，振荡混匀。
注：若溶液B 有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，摇匀后使用。
3. 将离心管置于75℃，孵育15min，期间颠倒混匀3 回，每回3-5次。
4. 室温放置 5min。
5. 加入 350μL 异丙醇，振荡混匀10sec。
6. 加入 30μL 磁珠悬浮液G，振荡混匀1min，共静置9min，每3min 振荡混匀1min。
注意：为了确保磁珠彻底重悬，请在使用前振荡混匀。
对于口腔拭子和干血斑等基因组DNA 含量少的样本，建议用15μL 的磁珠；
对于肌肉组织等基因组DNA 含量中等的样本，建议使用20μL 的磁珠；
对于鼠的脾脏等基因组DNA 含量高的样本，建议使用30μL 的磁珠。
7. 将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。
8. 加入 700μL 溶液C（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），振荡混匀30sec。
9. 将离心管放置于磁力架上静置 30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。
注意：如果对于DNA 纯度要求更高，可以重复步骤8 和9一次。
10. 加入 700μL 溶液D（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），振荡混匀30sec。
11. 将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。
12. 重复步骤 10 和11 一次。
13. 将离心管于磁力架上，室温晾干10-15min。
注意：乙醇残留会抑制后续的酶反应，所以晾干时要确保乙醇挥发干净。但也不要干燥太长时间，以免难以洗脱DNA。
14. 将离心管从磁力架上取下，加入100-200μL 溶液E（洗脱缓冲液），振荡混匀，置于56℃，孵育10min，期间颠倒混匀3 回，每回3-5次。
15. 将离心管放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，小心将DNA 溶液转移至一个新离心管中，并于适当条件保存。
二、移液法自动化仪器提取步骤
准备工作及注意事项：
1. 本产品可整合 Hamilton Microlab STAR、Beckman Coulter Biomek®FX 和Capitalbio LabKeeper 等移液法自动化仪器进行高通量基因组提取工作。
2. 组织样本的处理：同手工法样本处理，消化完成后转入 96 孔深孔板内。
3. 磁珠稀释液的配制：按照 30μL 磁珠悬浮液G 加入70μL 异丙醇的比例混合，混合后每个样本用量为100μL。
4. 对于 Hamilton Microlab STAR 类的仪器，有放置2 mL 离心管的板位，可以不使用异丙醇来稀释磁珠，异丙醇的加入体积仍为350μL。每个离心管可以放入1 mL 左右的磁珠，吸取磁珠前吹打混匀5次，直接进行30μL磁珠的分液操作，分液完成后将磁珠管盖盖好保存。
5. 对于动物脾脏、肝脏和肾脏等 DNA 含量丰富的样本，建议裂解后加入异丙醇吹打混匀5次以后，再加入磁珠进行混匀，避免磁珠聚集后不易进行充分的漂洗。
6. 考虑仪器设定温度和 96 孔板内的实际温度有一定的偏差，在裂解和洗脱时建议仪器设定温度比实际使用温度高出10℃。
提取步骤：
1. 在 96 深孔板(自备)中加入200μL 处理好的组织样本。
2. 每孔加入 300μL 溶液B(裂解液)，吹吸6次。
3. 将深孔板置于75℃，孵育15min，振荡混匀。
4. 将加热模块温度调至 25℃，继续振荡5min。
5. 每孔加入 270μL 的异丙醇，吹吸6次，然后振荡混匀5min。
6. 每孔加入 100μL 磁珠稀释液，吹吸6次，然后振荡混匀10min。
7. 将深孔板放置于磁力架上静置 2min，磁珠完全吸附后，吸去液体。
8. 将深孔板从磁力架上取下，加入 100μL 溶液C，振荡混匀2min。然后再加入600μL 溶液C，吹吸6次，然后振荡混匀2min。
9. 将深孔板放置于磁力架上静置 30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体。
注意：如果对于DNA 纯度要求更高，可以重复步骤8 和9 一次。
10. 将深孔板从磁力架上取下，加入 100μL 溶液D，振荡混匀1min。然后加入600μL 溶液D，吹吸6次，然后振荡混匀2min。
11. 将深孔板放置于磁力架上静置 30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体。
12. 重复步骤 10 和11 一次。
13. 将深孔板置于磁力架上，37℃晾干5min。
14. 将深孔板从磁力架上取下，加入 100-200μL 溶液E（洗脱缓冲液），置于65℃，振荡混匀10min。
15. 将深孔板放置于磁力架上静置 2min，磁珠完全吸附后，小心将DNA 溶液转移至收集板中，并于适当条件保存。
三、磁棒法自动化仪器提取步骤：
准备工作及注意事项：
1. 本产品在 Thermo KingFisher Flex 等自动化仪器上整合成功。
2. 组织样本的处理：同手工法样本处理，消化完成后转入 96 孔深孔板内。
3. 将 300μL 溶液B、700μL 溶液C、700μL 溶液D(漂洗液)和100-200μL溶液E（洗脱缓冲液）分别加到96 孔板相应的位置上，将30μL 磁珠G 加入到700μL 溶液C 中。
4. 使用磁棒法仪器也可以按照移液法仪器的操作步骤，需要裂解步骤完成后，设置暂停步骤再加入异丙醇。
提取步骤：
1. 将处理好的组织样本加入到含有溶液B(裂解液)的96 孔样品板里。
2. 将 96 孔板置于自动化提取仪中，75℃孵育15min，期间中速和快速间隔拍打混匀。
3. 仪器暂停后，每孔加入 350μL 异丙醇，快速拍打混匀5min。
4. 使用磁力套深入到含有磁珠的溶液C 的孔中，快速拍打混匀1min，吹散磁珠。
5. 磁力棒深入到磁力套中，吸附磁珠 3次，每次20sec。
6. 将磁珠转移到含有溶液A(组织消化液)和溶液B（裂解液）的孔中，释放磁珠，中速和快速间隔拍打混匀10min。
7. 磁力棒深入到磁力套中，吸附磁珠3次，每次20sec。
8. 将磁珠转移到含有第一遍溶液C 的孔中，释放磁珠，快速拍打混匀3min。
9. 磁力棒深入到磁力套中，吸附磁珠3次，每次20sec。
10. 将磁珠转移到含有第二遍溶液C 的孔中，释放磁珠，快速拍打混匀3min。
11. 磁力棒深入到磁力套中，吸附磁珠3次，每次20sec。
12. 将磁珠转移到含有第一遍溶液D(漂洗液)的孔中，释放磁珠，快速拍打混匀3min。
13. 磁力棒深入到磁力套中，吸附磁珠3次，每次20sec。
14. 将磁珠转移到含有第二遍溶液D(漂洗液)的孔中，释放磁珠，快速拍打混匀3min。
15. 磁力棒深入到磁力套中，吸附磁珠3次，每次20sec。
16. 磁力棒吸附磁珠后悬空晾干 5min。
17. 将磁珠转移到含有溶液E（洗脱缓冲液）的孔中，75℃孵育，快速拍打混匀10min。
18. 磁力棒深入到磁力套中，吸附磁珠 3次，每次30sec。
19. 将吸附的废弃磁珠转移到含有溶液D 的孔中，拍打混匀1min。
20. 程序结束后，小心将DNA 溶液转移至收集板，并于适当条件保存。
DNA 浓度及纯度检测得到的基因组DNA 片段大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
DNA 应在OD260 处有显著吸收峰，OD260 值为1 相当于大约50 μg/mL双链DNA、40 μg/ml 单链DNA。OD260/OD280 比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH 值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。