单细胞RNA扩增试剂盒说明书
产品编号：BTN130551
规格：80T
产品及特点：
一个哺乳动物单细胞一般只有约10pg 的总RNA，其中的mRNA 只有1-5%(约10E5-10E6 个分子),因此直接用单细胞进行mRNA 扩增具有极大的技术难度。本公司进过精心研究，整合最新技术，开发出了可以直接用单个细胞进行mRNA 扩增的试剂盒，其原理如下（仅以扩增mRNA 链为例）：
 
本产品具有下列特点：
1. 双向，既可用于制备正义的mRNA，也可用于制备反义的aRNA（antisense RNA）或cRNA（complimenary RNA）。
2. 直接用单细胞裂解液进行反应，免RNA 提取，整个过程只需要半天。
3. 适用于多种单细胞，包括卵细胞、干细胞、FACS 分离细胞等单细胞，还可用于培养细胞和胚胎等实体租组织（需要单细胞化），也可以使用10pg-10ng 纯化的总RNA 作为模板。
4. 假阴性和假阳性率均小于6%，RNA 扩增成功率为90%。
5. 所得mRNA 或aRNA（cRNA）可以直接用于后续的RT-PCR、芯片杂交、表达谱分析等实验。
6. 本试剂盒足够对80 个单细胞进行单细胞RNA 扩增。
规格及成分：

成分	规格
P1(cDNA 一链合成引物)	360μl
P2（cDNA 二链合成引物）	360μl
P3（T7-cDNA 二链合成引物）	100μl
溶液A（4×细胞裂解液）	100μl
溶液B（RI）	10μl
溶液C(逆转录酶)	40μl
溶液D	10μl
溶液E	10μl
溶液F	150μl
溶液G（TdT）	60μl
超纯水	10μl
PCR 3.0	9ml
转录预配液，2×	500μl
T7 RNA 聚合酶	50μl
说明书	1份

保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
PCR 纯化试剂盒，胶回收试剂盒，靶基因PCR 引物。
使用方法：
强烈建议首次使用本产品前，先预实验，用纯化好的任何总RNA 10倍系列稀释，直到浓度为25pg/μL，然后用0.4μL（即10pg RNA，相当于单个细胞的总RNA 量）按本操作说明书进行扩增，一次需平行做4-10 个重复。
下列步骤仅用于制备mRNA，如果需要制备aRNA（cRNA），则需要把P1 和P2 引物对换，其他成分不需要做任何改动。
一：新鲜准备工作液
见手册左侧各表，据此配制的的各工作液足够扩增10 个单细胞用。如果一次实验没有10个细胞，工作液的量仍需按10个细胞的用量新鲜配制，冰上放置时间不能超过1小时。
二：准备单细胞悬液
如何制备单个细胞取决于实验样品和所能使用的仪器设备，此处所列步骤仅供分离单个培养细胞的参考，本试剂盒不提供相关试剂。对其他材料（如干细胞克隆、2-8 细胞胚胎、胚囊、胚胎组织等）用户需自行选用合适的制备单细胞的方法。对已经处于单细胞悬浮状态的细胞（如FACS 分离细胞、卵细胞等），则可以跳过此步直接进入下步操作)：
1. 按常规胰酶方法处理培养细胞或组织，将细胞重悬于培养基中并计数。
2. 转移100-4000个细胞到离心管中，400g 离心4分钟，弃上清。
3. 将细胞沉淀重悬于50μL 自备PBS 中，使其终浓度为2-80个细胞/μL，所得细胞悬液可直接用于下面的反应。本方法一个管中可以处理1-40个细胞，但这些细胞必须是先分离成独立细胞的，不能是未分离的细胞团。
三：cDNA 合成和PCR 扩增
4. 标记10个0.5 mL PCR管（10 号设为阴性对照），按下表加入各成分：

成分	1-10 号样品管
RT 工作液（按下表1 配）	每管加4.0 μL，共10 管
细胞样品(来于第3 步)或10pg-10ng/μL 纯化的RNA	1-19 号加0.5 μL 样品（1-40 个细胞），10 号用0.5 μL 水代替
70℃水浴90 秒，转冰上放置1 分，短暂离心
溶液C（试剂盒提供）	每管加0.5 μL，共10 管
总反应体系为5μL，37℃水浴90m，70℃水浴10m，冰上放置1分钟，短暂离心
Tailing 预处理液（按下表2 配）	每管加1 μL，共10 管
短暂离心后PCR 仪上37℃ 30m，再80℃ 25m，离心后放冰上1m
Tailing 工作液（按下表3 配）	每管加6 μL，共10 管
短暂离心后37℃15 分钟，70℃10 分钟，放冰上1 分钟
上步反应管中每个取3μL 分别加入2 个新PCR 管做模板，共分得20个PCR 管。每个反应管中剩约6μL，作未PCR 对照放-20C 待用。
引物+水混合液（按下表4 配）	每个PCR 管加12 μL，共20 管
PCR Mix 3.0	每管加15 μL，共20 管
按（95℃3 分，50℃2 分，72℃3 分）参数循环1 次，冰上放1 分
P2	每管加1.5 μL，共20 管
自备PCR 级石蜡油	若PCR 仪无热盖，则每管加50 μL
（95℃30 秒，67℃1 分，72℃3 分，每次循环后在72℃的时间增加6 秒）循环20 次，4℃放置

5. 将模板来于一个样的2 管PCR 产物汇集，20 管汇集后将得10 管（对应于10 个样），每管30μL。只有循环数在24 次以上时电泳才能检测到PCR 产物，故此步不需要电泳检测。
6. 用自备的PCR 产物纯化回收试剂盒回收PCR 产物，去除残留的引物，50 μL 洗脱DNA，产物放-80C 长期保存。
7. 10 个样和其对应的未PCR 对照（共20 个样）各取0.5μL 为模板进行PCR 或定量PCR 分析，判断靶基因在哪个样品中得到了扩增和扩增效率如何。没有靶基因的可以选择看家基因。客户需自备相关引物和试剂。
四：制备含T7 启动子的模板（下列操作只针对10 个样品中的一个）
8. 选一个靶基因得到扩增的DNA 样品（第6 步回收所得），各取1 μL 加到10 个PCR 管中，各加29 μL 新鲜配制的PCR Mix（按下表5 配），混匀后按以下参数扩增1 次（95℃ 5m30s，64℃ 1m，72℃ 5m18s），再按以下参数扩增8 次（95℃ 30 秒，67℃ 1m，72℃ 5m18s，每次循环后将72℃延伸时间增加6 秒），PCR 结束后在72℃保温10m。
9. 汇集10 管PCR 反应液（共300 μL），用自备的PCR 产物纯化回收试剂盒回收PCR 产物，30 μL 洗脱。
10. 将30μL洗脱DNA全部上样到琼脂糖胶上进行电泳（只要电泳10分钟即可，否则胶体积太大，回收效率低），360nm紫外灯下切胶（250bp以上区域），最后用30-50μL 洗脱。此步所得PCR片段无250bp以下的非特异扩增产物，可直接用于后续体外转录。
五：T7 体外转录：请按该试剂盒的使用说明书操作（本产品含体外转录试剂）。
表1:RT 工作液

成分	用量
超纯水	30.8μl
溶液A	11μl
溶液B	1.1μl
P1稀	1.1μl
合计	44μl

注：P1 稀是将1 μL P1加入到100μL超纯水新鲜配制后得到，需新鲜配制。用户可在此步加入自备的内参，但超纯水的用量要相应减少。如加入2μL内参，则少加2μL 水。
表2:Tailing 预处理液

成分	用量
超纯水	8.8μl
溶液D	1.1μl
溶液E	1.1μl
合计	11μl

表3:Tailing 工作液

成分	用量
超纯水	42.9μl
溶液F	16.5μl
溶液G	6.6μl
合计	66μl

表4:引物+水混合液

成分	用量
超纯水	231μl
P1	33μl
合计	254μl

表5:PCR Mix

成分	用量
超纯水	132μl
P1	11μl
P3	11μl
PCR 3	165μl
合计	319μl