无氯仿柱式植物RNA提取试剂盒2.0说明书
产品编号：BTN160907
规格：50T
产品及特点：
本产品是无酚无氯仿柱式植物RNA提取试剂盒（BTN160906）的升级产品。不仅不需要氯仿处理，还解决了提取的植物总RNA中出现基因组DNA污染这一难题，提取的RNA通过PCR验证不含基因组DNA污染。该产品特点如下：
1. 免酚和氯仿处理，操作安全可靠。
2. 简单快速，处理一个样品只需要约十分钟。
3. RNA 纯度更高，平均 OD260/280一般都在2.0左右，能够有效去除大多数植物中的多糖污染。
4. 目前已测试过上百种植物。
5. 得到的RNA 可直接用于RT-PCR、Northern 杂交、cDNA 合成等实验。
6. 性价比高于进口的柱式植物RNA 提取产品。
规格及成分：

成分	规格
溶液A	50ml
溶液B	50ml
离心吸附柱	50套
通用洗柱液	100ml
膜反应液	2.5ml
RNase-free DNase（1U/μL）	0.5ml
RNA洗脱液	10ml

保存条件：
常温运输，4℃保存，DNase 低温运输保存，有效期一年。
使用方法：
1. 估算组织细胞的用量。每次微量提取一般需要100-200 mg 植物叶片、或50-100 mg 植物种子、或200-500 mg 植物果实。
2. 先将新鲜植物组织剪切成小块(保存在RNA保存液中的植物组织需用纸吸去RNA保存液体后再剪切成小块)，放入10-15 mL 塑料离心管中，加入1 mL溶液A，然后用匀浆器匀浆5-20秒。匀浆时会产生泡沫，但不影响提取效果。也可以使用液氮砚磨法破碎植物组织，砚磨完后加入1 mL溶液A。
注意：溶液A 在4℃放置后可能会产生沉淀，使用前必须放在65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用。
3. 将匀浆物或砚磨物转移至干净的1.5 mL 塑料离心管中(可以不必转移非液体的细胞碎片)。有的植物组织（比如果实）含有大量水份，匀浆液会多于1 mL，转移时也只取1 mL。
4. 室温12000-15000 g 离心3-5 分钟，管底沉淀为细胞破碎物。
5. 将上清液(约0.6 mL)转移到另一干净的1.5 mL 塑料离心管中。
6. 加入等体积的溶液B，充分颠倒混匀。如果有沉淀产生（对某些植物，属于正常现象），千万不要去掉沉淀，一定要把所有的混合物上柱。
7. 将一半的溶液（ 如果有沉淀， 则先混匀） 转移到离心吸附柱中，13000-15000 g 室温离心半分钟，弃穿透液。
8. 将剩下的一半溶液（如果有沉淀，则先混匀）转移到同一离心吸附柱中，13000-15000 g 室温离心半分钟，弃穿透液。
9. 加0.7 mL 通用洗柱液，室温离心半分钟，弃穿透液。再加0.3 mL 通用洗柱液，室温离心半分钟，弃穿透液。一般样品如此洗涤两次即可，但如果在第7 步加入溶液B 后有沉淀产生，则需要洗三次，每次加入的通用洗涤液的量分别为0.4、0.3 和0.3 mL。
10. 12000 rpm 室温离心10 秒以便去除残留液体。此步很重要，否则残留的通用洗柱液会抑制后续反应中DNase 的活性。
11. 将10 μL（10 U）的RNase-free DNase 加入到50 μL 37℃预热的DNA膜反应液中，吹打混匀配制成DNase 工作液。
12. 将DNase 工作液在37℃预热1 分钟，然后全部加入到离心吸附柱中，室温放置5 分钟。注意：5 分钟一般足够降解大多数情况下的DNA 污染。如果DNA 没有彻底降解（可能由于样品中残留的杂质抑制了DNase的活性），此步的保温时间可以适当延长到10 分钟或15 分钟。
13. 直接在离心吸附柱中加0.7 mL 通用洗柱液，盖上盖后颠倒数次混匀。
14. 12000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液。
15. 再加0.3 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，12000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液。
16. 12000 rpm 室温离心半分钟。此步十分重要，否则残留的乙醇（通用洗柱液中的成分）会影响RNA 的使用。
17. 将离心吸附柱转移到RNase-free 收集管中，加入30-50 μL RNA洗脱液，室温放置1-2 分钟。
18. 13000-15000 g 室温离心半分钟，离心管中溶液即为RNA 样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
19. RNA 完整性的电泳检测：如果需要做Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA 电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。
20. RNA 产量产率测定：将5-10 μL RNA 溶于TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），进而计算出RNA 的产量（浓度X 体积)和产率(RNA产量/组织用量)。
21. RNA 纯度测定：无污染的总RNA 的OD260/OD280 一般在1.8-2.1之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR 等反应。