可调式易错PCR试剂盒说明书
规格：100T
产品及特点：
易错PCR（error-prone PCR）是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的特性，在一定条件下（如不同的dNTP浓度、Mg浓度和MnCl2存在）能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法，则可从构建的突变库选出所需突变体。
本产品是在本公司的易错PCR试剂盒基础上改进而得，本产品具有下列特点：
1. 即开即用，十分简单方便，尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2. 配方经过精心优化，实验人员在一定范围内可以控制突变率，一轮PCR的突变率范围在2-8突变/1000bp，更高的突变率可以通过多轮PCR达到。
3. 可用于连续易错PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易错PCR的产物用作下一次易错PCR的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
4. 可以扩增的DNA片段更长，达到3kb，对于3kb以上的产物，建议分段扩增。
规格及成分：

成分	规格
Taq DNA聚合酶（5U/μL）	100μl
易错PCR Mix 2.0，10×	300μl
易错PCR专用dNTP 2.0，10×	300μl
易错PCR专用MnCl2	300μl
易错PCR专用dGTP	300μl
超纯水	1ml
说明书	1份

 
保存条件：
低温运输，-20℃保存, 有效期为一年。
自备试剂：
引物、DNA模板。
使用方法：
1. 将模板DNA稀释到1ng/μL。将引物稀释到10uM。注意：引物是决定易错PCR成败的关键因素，设计引物时要保证其Tm在70℃，长度在25-30nt之间，GC含量在45%-60%之间，3端GC含量低，并且没有发夹结构。
2. 根据每1000bp的预期突变数按下表确定易错PCR的反应条件中MnCl2和dGTP的用量。表中的A表示易错PCR专用的MnCl2, B表示易错PCR专用的dGTP：

预期突变数	2个	3个	4个	5个	6个	7个	8个
A的用量（μL）	0	1.0	2.5	4.0	4.0	4.0	4.0
B的用量（μL）	0	0	0	1.0	2.0	3.0	4.0

• 以30 μL的标准PCR反应体系为例，如果反应体系不是30 μL，各成分需要按等比例增加或减少。在一干净的PCR管中，加入下列成分（注意：可以先计算出超纯水的用量，优先加水）：

成分	用量
超纯水	根据第2步加
易错PCR Mix,10×	3μl
易错PCR 专用dNTP,10×	3μl
易错PCR 专用MnCl2	根据上步
易错PCR 专用dGTP	根据上步
自备DNA模板（1ng/μL）	1μl
自备PCR引物(10μM each)	1μL each
Taq DNA聚合酶（5U/μL）	1μl

• 按已经优化的PCR条件进行一定循环数的PCR（循环数与突变率的关系见下表），然后取5 μL电泳检查。如果没有优化的PCR条件，一般可以先尝试下面的PCR条件(对1Kb长的模板而言)：

PCR前变性	94℃ 3分钟
易错PCR(循环30次)	94℃ 1分钟
	45℃ 1分钟
	72℃ 1分钟

注：易错PCR一般不需要热启动，也不需要在PCR结束后做延伸处理。长度每增加1Kb，时间延长1分钟。易错PCR循环次数决定每个核苷酸位置的突变几率，进而决定每个PCR产物可能的突变位点数，所以所需循环数由客户根据需要改动。
5. 电泳检测是否得到预计长度的PCR产物。
6. 克隆片段进行功能筛选、或者克隆后进行测序分析突变率、或者用此轮PCR的产物为模板，进行下一轮的易错PCR。
疑难解答：
Q：现象：没有PCR产物。
A：可能原因：一是引物没有优化，可以重新设计引物；二是模板DNA太少，可以增加用量；三是模板不纯，最好先胶回收；四是溶解DNA的溶液中有EDTA，降低了PCR反应体系的Mg离子浓度，可以适当补加Mg离子。
Q：现象：太多的PCR条带或PCR条带模糊一片。
A：可能原因：一是PCR循环数太多；二是复性温度太低；三是延伸时间太长；四是引物没有优化，可以重新设计引物；五是PCR条件没优化，可以使用touch-down PCR；六是模板有其他DNA污染；七是DNA模板质量不高或者浓度太高。
Q: 如果需要更高的突变率，如何办？
A: 可以使用连续多次易错PCR来提高突变率。但最好先用胶纯化回收PCR片段,再用于下一轮易错PCR。此外不能用少于千分之一的第一次PCR产物作为第二轮易错PCR的模板，否则多样性将受到影响。第三轮易错PCR最好使用所有第二轮的PCR产物作为模板，但需要在10mL体系中完成（可以分成很多100μL体系进行）。