ADP/ATP发光法细胞活力检测试剂盒说明书
产品编号：BTN130802
规格：200T
产品及特点：
ATP参与多种酶促反应，维持正常的生命活动。多种激酶和ATP酶可将ATP转化成ADP。通过ATP和ADP的检测，可以观察这些酶促反应的进程。同时，ADP和ATP含量的变化，也与细胞的活性状态有密切关系；正常细胞发生凋亡及坏死时，ADP和ATP的含量，均有特征性的改变。
本试剂盒采用生物发光（bioluminescent）法，利用Firefly luciferase（萤火虫荧光素酶）催化底物Luciferin（荧光素）的转化，高效利用ATP的能量，发射出光子。发光信号与存在的ATP量呈正比，而ATP与存在于培养基中的细胞数目直接呈正比。ATP的检测灵敏度达到10-13 mol，故具有极高的敏感性。本试剂盒首先利用荧光素酶反应体系，测定样品中ATP的发光值，然后用ADP转换酶将ADP转化成ATP，再次利用同样的发光体系，测定样品中ADP转化所得的发光值。获得的结果可提供样品中ADP和ATP的相对含量及变化，从而了解酶促反应的进程或细胞状态的改变。该产品特点如下：
1. 高度敏感：灵敏度达到10^-13mol
2. 快速简便：加入制剂后迅速获得结果。
规格及成分：

成分	规格
100×细胞裂解液	1ml
ADT/ATP 反应缓冲液	10ml
Luciferin（荧光素)	0.5ml
Firefly luciferase萤火虫荧光素酶	1ml
ATP转化酶	1ml
说明书	1份

保存条件：
低温保存和运输， -20℃或-80℃避光保存，有效期6个月。
自备试剂：
PBS 、双蒸水等。
使用方法：
样品准备：
对体外酶促反应样品，一般可直接用双蒸水稀释后进行检测。样品中ATP含量应稀释到0.1 mM以下，以保证在测定的线性范围内。
培养哺乳细胞样品准备：
1) 配制裂解液：临用前，取适量100×细胞裂解液，用双蒸水稀释至1×，混匀。1×细胞裂解液可长期冻存于-20℃。
2) 细胞清洗：倾去培养板/皿中的培养液，加入足量PBS ，轻轻洗涤细胞。完全倾去洗涤液，胰酶消化后计数。如为悬浮细胞或部分悬浮细胞，应离心收集计数。细胞重悬于少量PBS中。
3) 细胞裂解：将一定数量的细胞悬液（如5000～50000个细胞）移入1.5 ml离心管，加入200～500 uL裂解液在涡旋振荡器上充分混悬震荡30秒，注意保持各样品的细胞浓度基本一致。裂解细胞可直接用于发光测定，也可离心30秒，取上清做发光测定。裂解细胞含量较多时，可将样品用双蒸水稀释，以保证在测定ATP的线性范围内。
配制发光反应液：
测定前，在室温待（ADP/ATP 反应缓冲液）ATP Assay Buffer 和荧光素（Luciferin）溶化，混匀（注意避光）。按20/1 比例用ADT/ATP assay Buffer稀释Luciferin，再加入1/10 体积的荧光素酶（Luciferase），配制所需体积的Assay Reagent（注意避光），置冰上待用。
测定仪器的设置：
按仪器操作说明开启发光测定仪。手动操作型仪器，将测读时间设为10-20秒。自动操作型仪器，一般将测定延迟设为2秒，将测读时间设为10-20秒，Assay Reagent的注入体积设定为50 μL。
手动发光测定：
取待测样品5 μL加入测量管底部，取Assay Reagent 50 μL加入管底部，轻轻敲击管壁3～5次混匀，放入仪器中立即测定，测读时间设为10-20秒，记录发光值为ATP的发光单位(RLU)，和CPM值(A值)。如用多孔板同时手动测定多个样品，则将各待测样品5 μL分别加入连续的各孔底部，用多道加样器于各孔底加入Assay Reagent 50 μL，轻轻敲击板侧3~5次混匀，放入仪器中立即测定，测读时间设为10-20秒，记录发光值为ATP的发光单位(RLU)，和CPM值(A值)。10 分钟后，重复测定，测读时间设为60秒，记录发光值为ATP的残余发光单位(RLU)，即CPM值(B值)。各管/板孔底部再加入稀释的ATP转化酶 10 μL，等10 min后，重复测定，测读时间设为60秒，记录发光值为ADP转化的发光单位(RLU)，即CPM值(C值)。
自动发光测定：
配制好的Assay Reagent和稀释的ATP转化酶均置于测定仪内，并分别连接好对应管道。Assay Reagent的注入体积设定为50 μL，设定立即测读10-20秒和10 min后测定60秒；ATP转化酶的注入时间设定在以上测读后，体积设定为10 μL，设定10 min后测读60秒。各待测样品5 μL分别加入测定，启动自动测量程序。记录ATP的发光CPM值(A值)、ATP的残余发光CPM值(B值)和ADP转化的发光CPM值(C值)。
结果计算：
样品中ADP与ATP的相对比值可按公式计算： ADP/ATP＝(C-B)/A对于细胞样品，通常，坏死细胞比凋亡细胞ADP/ATP有更显著的增高。
备注：
1) Assay Buffer，Luciferin、Luciferase和ATP转化酶应避免反复冻溶，可分装成合适体积分次使用。配制好的Aassay Reagent不能长期保存。
2) Luciferase 活性可被多种物质如一些去污剂抑制，设计和分析实验结果时，应考虑到这个因素。
3) 测定样品量可设定为2～20 μL；Assay Reagent加入量也可增加至100 μL。但应保持整个实验的一致性。
4) 用多孔板同时手动测定多个样品时，要尽量缩短样品间试剂加入的时间间隔。
5) ATP 检测的灵敏度与样品处理方法、发光测定仪器的灵敏度等均有关系。可先进行一个简单的预实验以确定设计实验的灵敏度和ATP 检测的线性范围。